Pr. emeritus Jean-Pierre HERVEG MD, Universidad Catolica de Louvain
Escuela de Medicina
(Bruselas)
(in English): http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/secondesemaine/transformation/transform.html
Atelier de genetica molecular SBIM 2520, Promocionado por PROMEGA NL.
contage de las celulas de mamiferos
para manana transfectarlas con un plasmido que expresa (codifica ) ß-gal (galactosidasa)


Maritza BARCIA MACAY* (Pharmacist) and Daniel RUIZ** (Erasmus)
*Universidad de Guayaquil, Ecuador, ** Universidad de Alcalá, Madrid, España, España

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Plan del dia:

a. centrifuga las celulas
b. Enterate de que es una
camara Burker
c.
cuenta las celulas
d.
Incuba 2 milliones de celulas por placa

 

en tu cuaderno de notas,
debes describir este trabajo como parte de los objetivos de la semana (respondiendo a las preguntas de: por que hacemos esto o lo otro?).
Recuerda que tus notas son tan importantes como tu trabajo manual. Escribelas de forma clara y precisa, para que en caso de accidente o vacacion cualquier persona pueda comprenderlas... Ademas en ciertos casos un Comite Etico puede pedir que las muestres para verificarlas...

 

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a. centrifuga las celulas

 

Bajo la campana de flujo laminar:
Recoje las celulas
aisladas utilizando un pipeteador (aspirador) electrico, y una pipeta de 5 ml .
Toma aparte una aliquota de 0.2 ml que servira para el contaje de las celulas

Mete el volumen sobrante en un tubo de ensayo esteril.
Cierra los tubos, y centrifuga en la centrifuga SORVALL GLC-2.

equilibra los tubos (por pesado)

centrifuga las celulas a 1200 rpm, temperatura ambiente, 2 min.

electricidad
tiempo

comienzo
velocidad (rpm)

regresa a la camara de flujo laminar:
resuspende las celulas en 10 ml de medio de cultivo .

cuenta las celulas, con la alicuota de 0.2 ml tomada.


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b. Que es una camara Bürker ?

Una camara Bürker, es una camara de contaje celular que consiste de 2 areas identicas (plataformas) delimeteadas en cuadrillas y montadas en un soporte de vidrio (mira la foto arriba). Cada plataforma esta cuidadosamente dividida en cuadrados de 1 mm (como se ve en la figura de abajo).

La superficie de este gran cuadrado contiene 9 cuadrados. A cada lado de las plataformas hay una elevacion (como un puente), donde se coloca un cubre-objeto y donde debajo de el se introduce la muestra.

.

 

La distancia entre el cubre-objeto y las ranuras en la superficie de la camara es 0.1 mm. El volumen contenido en 1 mm cuadrado es por tanto 0.1 mm cubico

 

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c. contaje de celulas

mezcla bien las celulas y pipetea 90 µl en un tubo de microcentrifuga.
anade 10 µl de azul de Trypan al 0.5% w/v en PBS. Mezcla.

Has hecho una dilucion 1:10.
Humedece los lados de la camara con tu saliva. Ahora pon el cubre-objeto y presionalo suavemente hasta que puedas ver anillos (Newton rings).
Los anillos de Newton indican la altura de la camara (0.1 mm).

Llena la camara por capilaridad en la plataforma del microscopio, usando una pipeta Pasteur. Colocala en posicion del lente.

En unos segundos las celulas se estabilizan en la camara.
Para evitar evaporacion, cuenta las celulas en el minuto siguiente: la luz del microscopio calienta la muestra

Cuenta el numero de celulas en los 4 cuadrados de uno de los cuadrados mas grandes (de cualquier gran cuadrado seleccionado) cuenta tambien las celulas de los bordes elegidos (por ejemplo arriba e izquierda). Calcula el promedio de tu contaje
Has contado el numero de celulas en 0.4 mm cubicos. Normalmente se cuenta entre 10 y 100 celulas sin problemas; si has contado un numero mayor, debes diluir tu muestra y tomar esta dilucion para realizar tus calculos .

1/5 : 20 µl celulas + 70 µl medio + 10 µl azul trypan
1/10 : 10 µl celulas + 80 µl medio+ 10 µl azul trypan
1/20 : 5 µl celulas + 85 µl medio + 10 µl azul trypan

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d. incuba 2 millones de celulas por placa

 

Pregunta por las placas de cultivo (tissue culture dish). Se parecen mucho a una placa de petri pero no son iguales. Son diferentes a las usadas con E. coli. Abrelas y mantenlas en la camara de flujo laminar.


Calcula el numero de celulas en tu precipitado tomando en cuenta el volumen original y las diluciones realizadas . Anade suficiente medio para obtener 2 milliones de celulas por ml (usualmente si has trabajo correctamente, deberas tener 14 ml de suspension bacteriana).

Añade 1 ml (2,000,000 celulas) a una placa de cultivo (ver la foto a tu derecha) que contiene10 ml de medio de cultivo de celulas

incuba durante la noche a 37°C en estufa con O2/CO2 .

 

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Destapa un tubo de ensayo, mezcla su contenido agitando.`

Toma 1 ml (usando la pipet aid).

Anadelo gota por gota en la placa de cultivo con los 10 ml de medio de cultivo.

Mete las placas en la estufa con 02/CO2 .

Desinfecta tus guantes con alcohol.

Abre la estufa y deja las placas durante la noche a 37° C.

 

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 las flechas rojas, de abajo, sumarizan lo que hemos hecho hoy con las celulas de mamiferos


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para manana transfectarlas con un plasmido que expresa (codifica ) ß-gal (galactosidasa)


Maritza BARCIA MACAY* (Pharmacist) and Daniel RUIZ** (Erasmus)
*Universidad de Guayaquil, Ecuador, ** Universidad de Alcalá, Madrid, España, España

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