Universidad Catolica de Louvain
Escuela de Medicina
(Bruselas)
(in English): http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/secondesemaine/transformation/transform.html

Atelier de genetica molecular SBIM 2520
Promocionado por PROMEGA NL.
1. transformacion de la bacteria
con el plasmido ß-Gal de expresion en mamiferos


Maritza BARCIA MACAY* (Pharmacist) and Daniel RUIZ** (Erasmus)
*Universidad de Guayaquil, Ecuador
** Universidad de Alcalá, Madrid, España, España

regresa a la segunda semana de trabajo

PLAN del dia

a. prepara la bacteria en crecimiento logaritmico. Distribuya este pellet bacteriano en alicuotas de 10 ml
b. Cambia el medio y disminuye el volumen de CaCl2

c. incuba 0.2 ml alicuotas durante la noche..

Prepara placas Petri para el dia siguiente (agar de base que contenga ampicilina).

Prepara la bacteria a ser transformada por el plasmido que queremos clonar. Transformar una bacteria significa insertar una molecula extrana de DNA en ella. El metodo es una especie de receta de cocina. Aqui la receta incluye una incubacion durante una noche con calcio, seguida de un shock termico. Esto supuestamente "abre" la bacteria por un tiempo suficiente para dejar que se trague el DNA. Hay otros metodos y debes aprender sobre ellos ...


a. prepara una bacteria en crecimiento logarithmico

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toma 1 ml de LB esteril como blanco para el espectrofotometro.
inoculate 50 ml of LB in a 100 ml flask with
50 µl of JM109 E. coli in glycerol


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Agita vigorosamente durante la incubacion!

 


stopun espectrofotometro HTACHI

Cuando el cultivo alcance la densidad optica (OD) de 0.4, mete tu erlenmeyer en el hielo para parar la reaccion (crecimiento bacteriano)
Toma entre 2-4 hrs para producir 5 x 10 miliones celulas

 

 

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b. distribuye el pellet de la bacteria
en alicuotas de10 ml

Manten el cultivo en el hielo durante 10 min. Mete tambien la solucion de tris-CaCl2 , la necesitaras hoy mas adelante
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prepara alicuotas de10 ml en tubos Falcon y vigila las lineas azules de volumen. Debes pipetear EXACTAMENTE 10 ml para equilibrar la centrifuga.
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.................................


Para equilibrar bien la centrifuga los tubos que contengan el mismo volumen estaran colocados diametralmente opuestos tal y como se muestra en la imagen superior.
Centrifuga los tubos Falcon en la centrifuga J6 a 1200 rpm, 11 min, 4° C.


elimina el sobrenadante usando una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacio.


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c. cambia el medio y disminuye el volumen de CaCl2

Resuspende la celulas en 5 ml de una solucion helada y esteril de CaCl2
Manten la suspension de celulas en bano de hielo durante 15 min.
..............................

 

centrifuga otra vez.
elimina el sobrenadante
resuspende las celulas en 670 µl de la solucion de CaCl2

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d. incuba durante la noche.

dispon alicuotas de 0.2-ml en microtubos previamente enfriados
Manten las celulas durante la noche a 4° C

 

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