Promocionado por PROMEGA NL
Universitad catolica de Louvain, Facultad de Medicina 


molecular genetics workshop SBIM 2520
subclonado de fagos
Maritza BARCIA MACAY* (Pharmacist) and Daniel RUIZ** (Erasmus)
*Universidad de Guayaquil, Ecuador
** Universidad de Alcalá, Madrid, España
regresa a la primera semana de trabajo
by Jean-Pierre HERVEG MD, emeritus,
herveg@bian.ucl.ac.be.nospam
and Christian REGAERT


limpia tu mesa de trabajo
plan del dia

1. subclona una colonia
..............a. selecciona la colonia que quieras clonar
..............b. infecta la bacteria

..............c. medio de clonado
..............d. control optico del crecimiento
..............e. cuantificacion del crecimiento de E.coli
2. separa los fagos del deshecho (debris) bacteriano
3. cuenta las unidades formadoras de colonias
4. preguntas

....???......................?



1. subclona una colonia.

a. selecciona la placa que quieras clonar

 

observa las cinco placas que incubaste durante la noche.
clasificalas de acuerdo con su correspondiente dilucion.
Toma una placa donde las placas esten bien separadas.
utilizando un microscopio observa el aspecto de una placa, esta turbia o clara?



selecciona una placa bien aislada,
seleccionala
usando una pipeta Pasteur con tetina.
usando la tetina pon la placa con agar en microtubos de 1.5-ml que contienen 100 µl de solucion SM
como la tetina es muy pequena, vigila que la placa aspirada esta metida en la solucion SM
Manten los microtubos durante la noche a
4° C.

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....b. Infecta la bacteria E. coli

añade
....0.5 ml de la E. coli que ha crecido durante la noche
....y 20 µl del lavado de la placa (plaque), o de una suspension de fago a un tubo vacio de microcentrifuga de1.5 ml
..Incuba a 37°C por 20 min
(en la estufa de microbiologia)



....c. medio de clonado

en un erlenmeyer de 100 ml
introduce 50 ml de LB supplementado con 0,5 ml de 1M MgSO4 y 0.5 ml de maltosa al 20 %
calentar a 37°C

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...
d. control optico del crecimiento

Toma 1 ml del medium non infected en una cubeta para tenerlo como control (blanco) para medir la densidad optica (OD) (at 600 nm in a
spectrophotometer)..

....
e. quantificacion del crecimiento de E.coli

transfiere 0.5 ml de la bacteria infectada en un erlenmeyer, agitalo a 37°C con buena ventilacionb en bano maria, comenzando a medir a la segunda hora, cada hora, chequeando la OD en relacion al control, en un espectrofotometro).


el medio debe aparecer turbio despues de 2 horas de incubacion y transparente despues de la lisis de las celulas (despues de aproximadamente 5 hrs).

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2. separar fago y deshecho celular (cell debris).


Este es un tubo Falcon

 


despues de la lisis

anade 0.5 ml de cloroformo por cada 100 ml of lisado,
transfiere 10 ml del lisado en tubos Falcon

centrifuge a 2,000 rpm 10 min para remover el debris.
cambia el sobrenadante a un tubo esteril
Manten en refrigeracion durante la noche a 4°C.

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.....


3. Titulacion de la unidad formante de placa (pfu).

entre las diluciones de las placas hechas ayer, elige aquellas que muestren placas (colonias) bien aisladas, y cuentalas bien, luego determina el pfu/ml de la suspension original de fago

Ayer mezclamos 5 diluciones de fago con una cantidad dada de bacteria. Como conocemos el voluemen que hemos metido en las placas, podemos calcular el pfu (plaque forming units) de la suspension inicial de fago


 

para ayudar en el contaje de colonias hay varios instrumentos en nuestro laboratorio. La siguiente foto muestra uno de ellos. Pon la placa invertida donde se indica. Simplemente al marcar una colonia con un marcador transmitira un impulso al contador.

 


Cuando hayas terminado, cierra las placas y metelas en la basura de deshechos amarilla (basura peligrosa).

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preguntas:

01. Cual es la differencia entre una placa turbia y una placa transparente?
02. Cuales son los factores que controlan el tamano de una placa?
03. Cual es la definicion de operon, monocistronico, polycistronico.
04. Describe como hace el promotor del operon lac para regular la expression de este operon.


05. Es posibles utilizar alpha complementacion con clonage de fago lambda ?.
06. Como prepararias una biblioteca genomica de fagos?.
07. Cuantos clones differentes esperarias conseguir para meter en marcha una biblioteca genomica humana de fagos.
08. Por que es importante calcular el pfu de una collecion de fago recombinante

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