Promocionado por PROMEGA NL
Universidad Catolica de Louvain, Escuela de medicine (Bruselas, Belgium)


atelier de genetica molecular
purificacion del DNA del fago
regresa a la primera semana de trabajo

Maritza BARCIA MACAY* (Pharmacist), Daniel RUIZ** (Erasmus), Jean-Pierre HERVEG (Emeritus)***
*Universidad de Guayaquil, Ecuador, ** Universidad de Alcalá, Madrid, España, ***Universidad Catolica de Louvain, Belgica

Plan del dia

1. materiales
2.
digestion del acido nucleico bacteriano
3.
peleteado del fago
4. elimina el
material insoluble
5.
liga el DNA a la resina: lavala
6.
DNA elucion and cuantificacion
7. preguntas

primero, prende el bano maria y el espectrofotometro.

....................


1. Materiales

 ..............


El kit utilizado: lambda Preps DNA Purification System de Promega, con los siguientes reactivos:


Alguien debe resuspender la mezcla de nucleasa !

disuelva la mezcla de nucleasa en su solucion buffer. Para lo cual, pipetee el buffer de su microtubo (eppendorf tube) al tubo con la nucleasa. Centrifuge rapidamente para mejor resultado.

Ve al comienzo


2. Digestion del acido nucleico bacteriano


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(los fagos con DNA estan protegidos por una capside proteica).
transfiere 7.5 ml del sobrenadante (ayer lisado) a 15-ml tubos corex esteriles.
anade 40 µl de la resuspension de nuclease mixture (guardada en hielo)
Incuba a 37°C durante 30 min

Ve al comienzo

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3. peleteado del fago

anade 3 ml de la mezcla de "Phage Precipitant", mezclar suavemente y mantenga sobre hielo por 30 min.


centrifuga a 3000 rpm, 20 min, 4°C en la centrifuga J5 (puedes verla en la imagen de la derecha)

 

 

 

 

 

 

 

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con mucho cuidado decanta el sobrenadante usando una pipeta Pasteur esteril con tetina.

es posible que encuentres dificultad para ver el pellet porque suele ser de color blanco o muy claro, y puede encontrarse en las paredes del tubo de centrifuga

Keep the pellet! 

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4. elimina el material insoluble

resuspende el pellet en 500 µl de fago Buffer mediante el pipeteo (pipetea abajo/ arriba). Pipetea el fago Buffer en su tubo, varias veces, para asegurar la resuspension completa del pellet

transfiere el pellet resuspendido (fago) a un microtubo de 1.5 ml.

centrifuga el microtube Eppendorf por 5 min, 12,000 rpm para eliminer las particulas insolubles.
pipetea el sobrenadante, teniendo cuidado de conservar el pellet .
transfiere a un micro tubo esterial.

Mezcle cuidadosamente la resina de purificacion (Purification Resin) antes de tomar la aliquota

????

 


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5. Ligado del DNA a la resina y lavado
a. Ligado


anade 1 ml de la resina de purificacion (Purification Resin) a el sobrenadante y mezcle 10 veces mediante la inversion del tubo.

De cada lisado (lambda lysate purification), prepare une Mini columna. Una el embol de la jeringuilla a la extension Luer-Lok

pipetee la mezcla de resina/lisado en la jeringuilla misma, absorbe esta mezcla en la Mini columna usando una bomba al vacio


la resina es un silicato.

Liga DNA.
El agua caliente despega el DNA ligado.
Si el DNA que se va a separar es mas largo que 2000 bp, la temperatura del agua de lavado debe ser lo mas alta posible

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5. Liga DNA a la resina y lavalo
b. lavado



pipetea 2 ml de 80% isopropanol en la jeringuilla
Aspira el isopropanol a traves la Mini columna

remueve la jeringuilla y transfiere la Mini columna a un microtubo de centrifuga de 1.5 ml.

corta la tapa del microtubo de centrifuga .
(Veras que no podras cerrar la tapa del microtubo de centrifuga debido a la mini columna. A alta velocidad, los tubos mal cerrados pueden saltar y causar dano a la centrifuga. Por lo tanto, no te olvides de cortales la tapa antes de centrifugar).

centrifuga la Mini columna : en Eppendorf, centrifuga, 2 min, 12,000 rpm para secar la resina

transfiere la Mini columna a un tubo de micro centrifuga limpio. Cortale la tapa.

Evita tocar la extremidad de la Mini columna : tienes que mantenerla limpia.

Ve al comienzo????

.....


pre-calentado del bano maria (con agua destilada) a 80°C


6. lavado del DNA y cuantificacion

a. lavado
Anada 100 µl of preheated (80°C) water.
immediatamente centrifuga (en tubos Eppendorff) la Mini columna por 1 min, 12,000 rpm para lavarle el DNA

Saca y deshecha la Mini columna.
El DNA lambda purificado puede ser guardado en el tubo de micro centrifuga a 4°C.

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b. cuantificacion
usa el espectrofotometro hitachi U-1100 y aprende el methodo

mezcla:
DNA lambda purificado 60 µl
agua destilada 540 µl

Realiza lecturas a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm permite la calculacion de la concentracion de acido nucleico en la muestra:

50/1.0 = (DNA)/OD read
(DNA) = 50 x OD read

c. control de calidad
el radio OD 260/OD 280 debe ser entre 1.8 and 2,0. si es menor, debes purificar otra vez.

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preguntas
pregunta
01. Como se protege el DNA del fago de la accion de la mezcla de nucleasa en esta minipreparacion?
02. Por que se mantiene la mezcla nuclear sobre el hielo?

03. Por que medimos el radio de densidad optica de 260 nm/280 nm.

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