Univesitad Mayor San Simon, Cochabamba (Bolivia) 2004
y


atelier de genetica molecular
Contaje de placas de lisis
Maritza BARCIA MACAY* (Pharmacist) and Daniel RUIZ** (Erasmus student) y Dr Jean-Pierre HERVEG (emeritus)***
*Universidad de Guayaquil, Ecuador, ** Universidad de Alcalá, Madrid, España, Universitad de Louvain, Belgica.
regresa a la primera semana de trabajo


teoría
.......biología molecular : Fago lambda
.......(JP Herveg y M Barcia-Macay)
Material:
.......pipetas



plan del día:

1. Selecciona el material a usar : presentación del material
2. Prepara placas de agar con dos capas:
........
.........la capa inferior
con mayor concentración de agar: 1,5 g % (agar de base,. ........bottom agar)
.........la capa superior a partir de una dilución 1/1 de la misma (agar
........superior, top agar)
3. Estériliza en una olla de presión:
el agar de base (en erlenmeyer) y el agar superior (en tubos de ensayo).
.........
4. Vierte el agar de base en las placas (en la cámara de flujo laminar)
5. Manten el agar superior a 47 °C
mientras infecta la E. coli. competente
.........
6. Siembra la E. coli infectada (mezclada con el agar superior a 47°C) y viertelo sobre el agar de base. Dejalo enfriar antes de meterlo en la estufa.

.........
7. Contestar las preguntas



a continuación

1. Selecciona el material a usar : presentación del material


Si paseas alrededor del laboratorio veras centrífugas, estufas, ollas a presion... ten presente que debes aprender a trabajar solo, sin ayuda del personal


 

 

Presentación del material que necesitaras hoy:

 

1. 5 placas Petri estériles (90 mm). Numeralas y retulalas.
2. 5 tubos de ensayo con tapas de metal, repite la operación anterior.
3. Erlenmeyer provisto de buchón estéril (escribe tus iniciales).
4. Una botella de medio LB
(estéril).
5. bacto-agar (encuentralo en la caja))
6. Una botella con MgSO
4 (estéril).
7. Una botella con maltosa 20 % (estéril).
8. balanza (encuentrala)
9. pipetas Gilson y puntas

Uso de la cámara de flujo laminar para la manipulación...

Aprende a usar el mechero Bunsen correctamente

Debes aprender a compartir los trabajos diarios

Nombra a alguien que supervise la olla de presion durante la estérilizacion, el llenado de las cajas con puntas, el hielo y el agua destilada, los baños maria, refrigeradora, cocineta, fagos y celulas competentes...
y un supervisor general que supervise todo...


a continuación

2. Prepara placas de agar con dos capas :
prepara el agar de base y diluye 1/1 para preparar el agar superior.

1. prepara el agar
de base

Disuelve 1.8 g agar en 120 ml of medio LB suplementado con 1.2 ml de 1 M MgSO4 y 1.2 ml de 20% maltosa.
Ponlo en la llama agitando para disolverlo

2. prepara 5 tubos con agar superior

Mete 1,5 ml de la mezcla anterior en tubos y añade 1,5 ml de medio LB.


3. cierra tubos y erlenmeyer

Tapa el erlenmeyer con un buchón de gasa y los cinco tubos con tapónes de metal y metelos a estérilizar en la olla de presion.


a continuación

3. esteriliza agar de base y superior. Vierte agar de base en placas.

 

Estériliza en la olla de presion durante 20 minutos a una presion de 1 bar.

 

 

 

Cuando el agar alcance una temperatura alrededor de 50°C distribuye el agar de base en placas, virtiendo lentamente a un volúmen suficiente para formar una especie de "U" que cubra toda la placa, tal y como se muestra en la imagen superior. Vierte espontaneamente. Manten las placas semi-abiertas ...

 

 

 

regresa al comienzo


Manten las placas con agar de base en una lunaa cámara de flujo vertical como en la foto de abajo



o en una
cámara con flujo horizontal....

 

o en tu mesa de trabajo alrededor de la llama de un mechero

 

lava el erlenmeyer antes de que el agar se endurezca


a continuación

4. manten los tubos con agar superior a 47° C mientras infecta la E. coli. competente

manten los tubos en baño maria a 47° C

pide la E. coli competente y organiza tú área de trabajo

organiza tú área de trabajo
(como en la foto de arriba a la derecha)

Proveete de la bacteria competente E coli MRA P2 en la estufa.

busca la suspensión de fagos. Nombra a alguien responsable por el mantenimiento de la bacteria y de los fagos, de tal manera que sea más fácil de encontrarlos.

Pon:
2 filas con 5 tubos de micro-centrifuga estériles:

numerados 1 a 5 (primera fila)
numerados 1' a 5' (segunda fila)

medio SM (Salt magnesium medium).
Pipeta de 1000 µl + una caja de puntas azules ( pipetea 270 µl)
Pipeta de 100 µl + una caja de puntas amarillas (pipetea 30 µl.



infecta la bacteria con diluciones de fagos

Prepara diluciones seriadas como a continuación:
en todos los tubos de la primera fila
añade 270 µl de medio SM

despues añade 30 µl de fago al primer tubo y mezclalo

toma 30 µl de ésta mezcla, y añadela sobre el segundo tubo. Mezclalo cuidadosamente

repite esta operación hasta el quinto tubo.

infecta la E. coli con diluciones de fagos
transfiere 100 µl de cada tubo de la primera fila al tubo correspondiente de la segunda fila .
añade 100 µl de la bacteria competente a cada tubo de la segunda fila.

Incuba durante 20 min a 37°C en una estufa


a continuación

5. placa infectada de E. coli. (mezclada con el agar superior)

 

añade 100 µl de la suspensión infectada de E. coli en los tubos de ensayo esterilizados con los 3 ml de agar diluido (47°C) top agar.
Mezcla evitando que aparezcan burbujas de aire

Immediatamente vierte el contenido del tubo en el centro de una placa petri numerada que contenga ya el agar de base, evitando hacer burbujas .

balancea la placa lentamente para asegurar una distribución uniforme

Repite ésto con el resto de las suspensiones bacterianas
Cierra las placas Petri y guárdalas durante 10 min en la nevera (4°C) para permitir que el agar superior se endurezca. Invierte las placas e incubalas a 37°C en la incubadora para procariotas

 

 


...............................


a continuación

mañana tendras un crecimiento como esto:


6. preguntas.

 

1.¿que son células competentes?

2. ¿ cuál es el precio comercial de las células competentes?
3. ¿por que hemos incubado E.coli durante toda la noche en 20 % de maltosa para obtener las células competentes con las que hoy trabajamos?
4. ¿Cómo es que el plateado de fagos sirve para clonar y separar físicamente los clones?
5.¿ Qué son las diluciones seriadas?

6. comenta los siguientes conceptos: infección, transfección, transformación.
7. ¿Cuál es el tamaño promedio de los insertos en plasmidos, fagos, cosmids y cromosomas artificiales?
8. ¿cual es la diferencia entre fago litico y fago lisogénico?
9. ¿que es un fago atemperado?
10. imagina que tienes que explicar lo que has hecho hoy a aguien nuevo en este campo ... Que le dirías?

Univesitad Mayor San Simon, Cochabamba (Bolivia) 2004



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Maritza BARCIA MACAY* (Pharmacist) and Daniel RUIZ** (Erasmus student)
*Universidad de Guayaquil, Ecuador, ** Universidad de Alcalá, Madrid, España
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