Promocionado por PROMEGA NL
Universidad Catolica de Louvain, Facultad de Medicina 


atelier de genetica molecular SBIM 2520
Corte del inserto
Maritza BARCIA MACAY* (Pharmacist) and Daniel RUIZ** (Erasmus)
*Universidad de Guayaquil, Ecuador
** Universidad de Madrid, Espana
go back to first week plan, , Tuesday, Thursday.
by Jean-Pierre HERVEG MD, emeritus,
herveg@bian.ucl.ac.be.nospam
and Christian REGAERT


Plan del dia:
..........1. Utilizaremos
Not I, una endonucleasa de restritcion del tipo II
............ 2. Cortaremos (cortar) el inserto lambda DNA usando Not I
..........3. Purificaremos y determinaremos el tamano del inserto mediante el uso de la electroforesis en agarosa (agarose gel electrophoresis).
..........preguntas

Dr Etienne DE PLAEN
FARM2182 2002
...

 



2. Corte el inserto usando Not I

Las muestras para digestion y electroforesis se preparan en 1,5 ml microtubos de centrifuga
El volumen de reaccion es 20 µl.

Prepara los siguientes compuestos:

 10 x buffer D (not 1 buffer) 2 µl
 DNA sample  x = ........... µl
Not 1  1 µl
 agua libre de nucleasas para obtener un volumen final de 20 µl   y = ............ µl

Mezcla suavemente
Centrifuga rapidamente a 12,000 rpm
Incuba a 37°C durante 1 h al bano maria

Anade 4 µl del colorante: Blue Orange loading dye 6 X (1)
Las muestras pueden ser almacenadas en congelacion -20' C, o directamente metidas en un gel de
agarosa .

(1) Blue Orange loading dye 6 X , glycerol 7.5 %, Ficoll 2.5 %, Bromophenol blue 0.025 %

regresa a plan de trabajo.....

2. purificacion usando electroforesis

El gel
Pese 0.8 g de agarosa en polvo en un erlenmeyer .
Anada 100 ml de 1 x gel buffer solution
.....................Prepare 1 x gel buffer.
.....................10 ml 50 X gel buffer
.....................490 ml agua destilada

Calienta hasta disolver usando un mechero Bunsen, agitando suavemente todo el tiempo. Usa guantes!
Enfrie la solucion a 50°C (tu podras sostener el erlenmeyer con tu mano).
Anada 10 µl de bromuro de etidio (ethidium bromide) en solution al gel.
Atencion: usar guantes al manipular el bromuro de etidio

 

gel submarina en el tanque
Limpia cuidadosamente la camara plastica de electroforesis y su peine
Cierra los bordes del molde de la camara con cinta scoth de color
Vierte la solucion de agarosa tibia en el molde
Mete el peine cerca del borde de una esquina del gel
Despues de 30-45 min a la temperatura ambiente, remueve la cinta de color y el peine, y metelo en el tanque
Anade el resto del buffer (1 X gel buffer ), de tal manera que cubra el gel a una profundidad de cerca de 1 mm

Carga las muestras de DNA en las ranuras dejadas al sacar el peine del gel
Mete la electricidad en marcha, a 50 V por 1 hr

 

?????regresa a plan de trabajo



preguntas

1. Se puede usar el mismo buffer mientras se trabaja con 2 enzimas diferentes, como Not I y Eco RI en el mismo tubo?
2. actividad Star?
3. bromuro de etidio y sybergreen en el gel de electrophoresis?

 

 

?????regresa a plan de trabajo


 
1. Not I
Esta enzima es provista con los buffers D (10 x), multicore 25 % de sequencia de reconocimiento de Not-1
(recognition sequence of Not-1)

GC' GGCCGC
CGCCGG'
CG

Fuente bacteriana : Nocardia otitdis-caviarum
Manten la enzima en hielo mientras la usas (y en congelacion antes y despues de usarla)
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2. Eco RI (evite actividad star)
La enzima es provista con los tampones H (10 x), multicore 100 % con secuencia de reconocimiento
(recognition sequence) de Eco RI

G AATT C
C TTAA
G

Fuente bacteriana source: Escherichia coli RY13
Mantenga la enzima en hielo mientras la usa (en el congelador antes y despues del uso)
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No olvides limpiar tu area de trabajo. Que tengas un buen dia. !

Promocionado por PROMEGA NL
Universitad Catolica de Louvain, Facultad de Medicina 


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