Universidad catholica de Louvain, Facultad de Medicina 

biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
las ADN polimerasas (las ADN pols)
Jean-Pierre HERVEG*, Maritza BARCIA-MACAY et Bernard LETHE*
Université Catholique de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.

plan
ejercicios

plan:

1. Introduction
2. dNTPs y ddNTPs,
3. Los cebadores.
4. El molde.
5. Las actividades exonucleasas de la DNA pol.
6. La Taq ADN Pol
7. Sintetizar ADN pol termoresistente.
8. ejercicios (cajas amarillos)


Cuestiones para el examen

1. Definir una ADN pol.
2. ¿ Los ADN Pols añaden los nucléotidos a la misma velocidad?
3. ¿ Qué un ddNTP?
4. ¿ Por qué se modifica la talla del sitio catalítica del ADN pol?
5. ¿ Cuál es la talla mínima de un cebador?
6. ¿ Cuál es la función del primasa?

7. ¿ Describa las actividades catalíticas del ADN pol?
8. ¿ Cuál actividad se supriman en ADN pol que sirven para la secunciaciòn y por qué?
9. Describir la " nick traslación".
10. ¿ Cuál es la función del ADN polymérase I?
11. ¿ Conoce a inhibidores del ADN pol.
12. ¿ Por qué la actividad endonucleasica 5 '---> 3 ' es utilizada en PCR en tiempo real?

a continuación


1. introducción

Una ADN polimerasa (EC 2.7.7) es una holoenzima que utilsa los dNTPs (desoxirribonucleótidos) o los ddNTPs (didesoxirribonucleótidos) para alargar el terminal 3' de un cebador (a primer) emparejado (annaeled to) a una molécula de ssADN(single strand DNA) que utilisa como plantilla o molde (template).

Todas las ADN pol conocidas sintetizan el ADN en la dirección 5' a 3'. Ninguna ADN pol conocida es capaz de comenzar una nueva cadena. Ella sólo puede añadir un nucleótido en un grupo 3'-OH que ya existe. Por esta razón la ADN pol necesita un cebador al grupo 3' -OH del cual puede añadir el primer nucleótido.

Los cebadores son moléculas de ADN o ARN. La longitud mínima de un cebador esta de 17 nt. Usted tiene que o sintetizarlos o comprarlos. Cualquier estudiante debería saber escoger y como comprar un par de cebadores.


1. introduction

A DNA polymerase (EC 2.7.7) is a holoenzyme that assists in DNA replication. It catalyzes the polymerization of dNTPs (deoxyribonucleotides) and of ddNTPs (dideoxyribonucleotides) alongside a template ssDNA. It "reads" this ssDNA using it as a template. The newly polymerized molecule is complementary and antiparallel to the template strand and identical to the template's partner strand.

All DNA pols synthesize DNA in the 5' to 3' direction. No known DNA pol is able to begin a new chain (de novo). They can only add a nucleotide onto a preexisting 3'- OH group. For this reason a DNA polymerase needs a primer at which it can add the first nucleotide.

Primers are RNA and DNA molecules. Their minimal length is 17 nt. You have either to synthetise them or to buy them. Any student should know how to choose and how to buy a pair of primers.


el ión de Magnesio:

ADN pol es un holoenzima. Esta requiere un co-factor, un ión de Magnesio, para funcionar correctamente. Sin el ión de Magnesio, esta enzima esta sólo un apoenzima.

Un "holoenzima" esta o la forma completa y activa de una enzima con múltiples subunidades o la combinación de un apoenzima con su cofactor.

Un apoenzima es una enzima sin su cofactor o sin sus múltiples subunidades. Para las ADN pols, el cofactor es el ión de magnesio.

En la reacción catalizada por ADN pol, los cebadores y el ADN quelatan el ión de magnesio. Entonces la concentración de este ión tiene que ser medida para cada reacción. A veces, hay que añadir el ion magnesium
the magnesium ion:

ADN pol is a holoenzyme. It requires a a co-factor, a magnesium ion, to function properly. Without the magnesium ion, this enzyme is only an apoenzyme.

A "holoenzyme" is either to the complete and active form of an enzyme with multiple protein subunits or the combination of an apoenzyme with its cofactor.

An apoenzyme is an enzyme without its cofactor. Here, the cofactor is the magnesium ion.

In the reaction catalyzed by ADN pol, the primers and the DNA chelate the magnesium ion. So the concentration of this ion has to be measured for each reaction. Sometimes, Mg++ had to be added to the medium.

La corrección de los errores:

Cierta, pero no todas, las ADN pols son capaces de corregir errores. Aquellas enzimas corrigen los errores hechos durante la síntesis de ADN. Cuando la ADN pol descubre un par de bases situada incorrectamente, Ella invierte su dirección y retira de un par de bases. Entonces esta enzima utiliza su actividad exonucleasica 3 '-> 5 ' para sacar cortando esta par de basa (este actividad es llamado "proofreading"). Después de este excisión, el ADN pol puesto ahora el correcto par de bases y la réplica puede continúar.

Retroviruses codifican una ADN pol llamada reversa transcriptasa (ADN RT pol). Este ADN pol es un ADN pol dependiente de ARN. Esto hace el ADN de una plantilla de ARN.
Error correction:

Some, but not all, DNA pol are able to correct errors. Those enzymes correct the mistakes made during the synthesis of DNA.. When an incorrect base pair is recognized, DNA polymerase reverses its direction by one base pair of DNA. The 3'->5' exonuclease activity of the enzyme allows the incorrect base pair to be excised (this activity is known as proofreading). Following this excision, the DNA pol put now the correct base and continue replication.

Retroviruses encode an unusual DNA polymerase called reverse transcriptase, (RT DNA pol). This DNA pol is an RNA-dependent DNA pol. It makes DNA from a template of RNA.

a continuación




El cebador va a fijarse un nucleótido (dNMP o ddNTP) con la liberación de un pirofosfato (ppi) y agua. La reacción se completa cuando el enlace de alta energía del ppi es hidrolizado por la pirofosfatasa inorgánica en dos pi (fosfato inorgánico). La acumulación de ppi o de pi inhibe por la reacción. El alargamiento de un cebador en el ser humano y en archaeas se realiza a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo mientras que en bacterias alrededor de 500 nucleótidos por segundo. La diferencia proviene del hecho de que los ADN pols de las bacterias no tienen corrector.

La propiedad de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN se utiliza para la reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés, para obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, amplificándolo para propósitos de investigación.


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2. dNTPs, ddNTPs y el ADN Pol

Los dNTPs son dATP, dTTP, dGTP ADN dCTP. Para el secuencaje de ADN, se necesitan una mezcla de dNTPs y ddNTPs (nucleótidos didesoxi). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxiribosa. La ADN Pol puede incorporar estos ddNTPs a la cadena de ADN naciente. Pero no es posible que se una a estos ddNTPs ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, una vez icorporado un nucleótido didesoxi, se termina la síntesis de la cadena de ADN.
El sitio catalítica del ADN Pol ha sido extendida para contener el ddNTPs fluorescente utilizados para la secuenciación del ADN.

3. Los cebadores

Los cebadores o "primers" son pequeñas secuencias de ADN o ARN (olignucleótidos) que se utilizan para iniciar la síntesis de ADN. Un cebador contiene una secuencia de al menos 17 nt de longitud. La primasa es una ARN polimerasa que sintetiza los cebadores que empiezan las secuencias de Okazaki en la replicación.

4. El molde:

El molde (la matríz) es una hebra de ADN o ARN. Hay 2 tipos de ADN polimerasa, polimerasa ADN dependiente que necesita el ADN como molde y polimerasa ARN dependiente que necesita el ARN como molde. Las ARN polimerasas que necesitan ARN como molde (DNA-polimerasa dirigida por RNA ) son las transcriptasa inversa (reverse transcriptase, RT-DNA pol).


(La síntesis de los oligonucleótidos)
a continuación



5. Las actividades exonucleasas de la DNA pol.

La ADN polimerasa son proteínas que además de las actividades polimerasas que poseen, tienen también actividades exonucleasas. Los ADN pol de tipo I terminán la replicación, eliminando los cebadores ARN en los secuencias de Okazaki y corrigiéndo los errores producidos por la polimerasa de tipo 3. Para realizar ésta actividad, una ADN polimerasa de tipo I posee dos tipos de actividades exonucleasas. Una actividad exonucleasa 5' ---> 3' que elimina todos los nucleótidos (ribonucleótido o desoxiribonucleótido) situados al final del cebador. Esta actividad es muy útil para la reacción en cadena en tiempo real y en la técnica del marcado de sondas denominada translación nick (nick translation). La otra actividad (3' ---> 5') es la actividad "proofreading", osea la correción de errores. Esta actividad no existe en los procariotas (bacterias), solamente en los eucariotas y archaea. Las polimerasas que poseen ésta actividad exonucleasas producen menos faltas pero son 10 veces más lentas.

Por ejemplo la Taq polimerasa de Thermus aquaticus (bactéria) añade 500-1000 nt por minuto a 72°.

Las ADN polimerasas termoresistentes fueron aisladas de organismos resistentes a temperaturas elevadas, bacterias ó archeae. Ellas permiten trabajar a temperaturas que permiten el aparamiento perfecto del cebador al molde. Estas polimerasas pueden resistir temperaturas de ± 70 donde pueden solamente perder hasta el 40% de ésta actividad por hora.

Las polimerasas se utilizan también para el secuencaje. Se considera que la actividad exonucleasa 5' ---> 3' destruye una parte de los cebadors y como tal se pueden encontrar polimersas desprovistas de éstas actividades.



6. La Taq ADN Pol

La Taq ADN Pol primero fue aislada de Thermus aquaticus en 1976 por Chien, D B Edgar, y J M Trela (Journal of Bacteriology 127 (3): 1550­1557). Este thermostable ADN pol (80 ° C) puede ser aislado sin otros contaminantes. Este enzima se hizo una fuente de renta enorme para empresas multinacionales.
 


7. Sintetizar ADN pol termoresistente.

Se pueden comprar la ADN pol, pero el precio es calculado para los utilizadores de los países muy ricos.Se puede preparar su propia ADN pol si se posee un plasmide que contiene el gen que codifica la enzima. Se transforma E. coli con este plasmide. Entre las proteínas producida, el ADN Pol es la única que, con la ribonucleasa, resiste 1 hora a 75°C. Él sobrenada de la cultura puede ser utilizado como enzima. Se puede purificar la proteína utilizando una resina adaptada.
 

Sumario:

ADN polymerasa I

ADN pol I posseses tres actividades enzimatica:

1. una actividad ADN pol 5 ' --> 3 '
2. una actividad exonucleasa 3 ' -> 5 ' que media la corrección
(proofreading actividad)
3. una actividad exonucleasa 5 ' -> 3 ' que media la "nick translation" durante la reparación del ADN

Durante la réplicación, la ADN pol I quito los cebadores de ARN de los fragmentos de Okazaki. Ella quita los nucleótidos de los cebadores en la dirección 5 ' -> 3 '.Esto crea huecos (vacíos). La ADN pol I lleno estos vacíos de nucleótidos. La ADN pol I hace también una corrección para errores como esto va. Esto es una enzima dependiente del ADN. Este enzime añade el nucléotides según la matriz de DNA. La ligasa entonces une varios fragmentos juntos en un hilo continuo de ADN.


Summary:

DNA polymerase I:

DNA Pol I posseses three enzymatic activities:

1. A 5' -> 3' DNA polymerase activity
2. A 3' -> 5' exonuclease activity that mediates proofreading
3. A 5' -> 3' exonuclease activity mediating nick translation during DNA repair.

DNA polymerase I removes the RNA primer from the lagging strand and fills in the necessary nucleotides (see DNA replication) in 5' -> 3' direction, proofreading for mistakes as it goes. It is a template-dependent enzyme, as it only adds nucleotides that correctly base pair with an existing DNA strand acting as a template. Ligase then joins the various fragments together into a continuous strand of DNA.

Despite its early characterisation, it quickly became apparent that Pol I was not the enzyme responsible for most DNA synthesis - E. coli DNA replication proceeds at approximately 1,000 nucleotides/second, while the rate of synthesis by pol I averages only 20 nucleotides/second. Moreover, its cellular abundance of approximately 400 molecules per cell did not correlate with the fact that there are typically only two replication forks in E. coli. Moreover, it is insufficiently processive to copy an entire genome, as it falls off after incorporating only 25-50 nucleotides. This was proven when, in 1969, John Cairns isolated a viable pol I mutant that lacked the polymerase activity. It was not until the discovery of DNA polymerase III that the main replicative DNA polymerase was finally identified.
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Research applications

DNA polymerase I obtained from E. coli is used extensively for molecular biology research. However, the 3' -> 5' proofreading activity is undesirable for many in vitro molecular biology applications. However, this activity can be removed by the proteolytic cleavage of the enzyme, which releases a large peptide known as the Klenow fragment. This fragment posesses only the polymerase and 5' -> 3' exonuclease activities.



biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
las ADN polimerasas (las ADN pols)
Jean-Pierre HERVEG*, Maritza BARCIA-MACAY et Bernard LETHE*
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