Universidad catholica de Louvain, Facultad de Medicina 

biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
enzimas de restricción
Jean-Pierre HERVEG* y Maritza BARCIA-MACAY**
*Université de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.

plan
ejercicio (cajas amarillos)

Plan

1. Introducción
2. Tipos de enzimas de restricción
3. Endonucleasas de restricción tipo II
4. Mapa de restricción
5. Isoschizomeros y familia de enzimas
6. Tallas de los fragmentos de restricción:
7. RFLP

Definición:

Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia de ADN entre 4-8 bp. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la enzima rompe un enlace fosfodiester en la hebra de arriba (sens) y otro enlace fosfodiester en la hebra complementaria (antisens).

Cuestiones para el examen

1. Definir una enzima de restricción.
2. ¿ Que hace una enzima de restricción ?
3. Describa las enzimas de restrction de tipo II.
4. Describa las enzimas de restrction de tipo III.
5. ¿ A partir de cuáles organismos se aislan enzimas de restricción ?
6. ¿ Que significa la palabra metiltransferasa?
7. Definir " una unidad " para las enzimas de restricción.


8. Definir un isoschizomeros para una enzima de restricción.
9. Definir cortes pegajosos, salientes o cohesivos.
10. Definir palíndromo.
11. ¿ Que significa Eco RI?
12. ¿ Qué una carta de restricción?
13. Describir una hidrólisis de restricción en práctica.
14. ¿ Cómo se determina la talla media fragmentos de retriction?
15. Definir un RFLP¿

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1. Introducción:

Las enzimas de restricción se encuentran en muchas especies de bacterias. Este sistema es análogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su DNA y el DNA exógeno. El DNA exógeno está último degradado por la enzima de restricción. El DNA propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas).

Un virus de bacteria (un fago) capaz de propagarse en una cepa bacteriana determinada no se replica cuando es cultivado en una cepa diferente. Casi siempre una pequeña proporción del fago es capaz de evadir este estado de restricción y crecer de manera adecuada en la nueva cepa bacteriana.
La progenie de este fago será incapaz de crecer en la cepa bacteriana que originalmente permitió la propagación del fago precursor. Estas observaciones sugieren que una modificación específica inducida por la nueva bacteria hospedera protege al fago de manera que no puede ser restringido dentro de la nueva cepa bacteriana, pero a la vez pierde la capacidad para crecer en la antigua cepa hospedera.

La modificación inducida por el hospedero ocurre en el nivel del ADN del fago, y el fenómeno de restriccion es consecuencia de la degradación por hidrólisis enzimática del ADN viral que no ha sido modificado.

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2. Tipos de enzimas de restricción

Tipo I

Una sola enzima que posee 3 subunidades reconoce el sitio de ADN¿ Esta enzima metila y restringe. La restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.

Tipo II

Dos enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos.


Tipo III

Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas, y rompen el DNA 25-27 bp, más allá del sitio de reconocimiento.

 

 


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3. endonucleasas de restricción tipo II

Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.

Se han identificado más de 2300 endonucleasas de restricción de tipo II. Se denominan Isoschizomeros a aquellas enzimas que han sido obtenidas de diferentes especies de bacterias, pero que reconocen la misma secuencia de DNA.
Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes:

A. Cortes pegajosos, dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco RI y Pst I



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Cortes simétricos, dejando productos con extremos romos
Ej: Pvu II


Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos ciegos y con extremos escalonados), en ingenría genética se prefieren aquellos con extremos complementarios, puesto que permiten la unión espontánea del gen a clonar con el vector. Si las moléculas a utilizar presentan extremos ciegos, hay que conferirles extremos cohesivos, por ejemplo utilizando la enzima transferasa terminal.


Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palíndrome (se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda). La nomenclatura que se sigue para designar las enzimas de restricción es son las siguientes:

Eco RI
E = Escherichia, género
co = coli, especie


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4. Ejemplos de enzimas de restricción tipo II:


 

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4. Mapa de restricción

Un patrón de ADN genrado mediante electroforésis que se produce después de cortar con una enzima de restricción.

Muestras de ADN en un tubo de microcentrifuga: 30µL de ADN bicatenario con concentración de 0,1 µg/µL y la longitud de 10.000 bp.


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poner 10 µl de ADN en los tubos de microcentrífuga, 7 µl de agua, 1 µl de enzima de restricción Eco RI
y 2 µl de la solución tampón 10X para enzimas de restricción Eco RI.
Metzclar y centrifugar.
Poner a baño Maria (37°C) por 1 hora


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Con la ayuda de una pipeta, pasar los hidrolisados a un pocillo de electroforésis en gel de agarosa En uno de los tubo adycentes, depositar una muestra de ADN no hidrolisado y en otros dos, una mezcla de moléculas de ADN de tamaño conocido (marcadores), que servirán para calcular las tallas de los fragmentos obtenidos.

Aquí, una lista de los reactivos que se necesitan para realizar una electroforésis:

Agarosa
Solución tampón o Buffer para electroforésis 1 x TAE
Colorante fluorescente de Bromuro de etidio
Dos colorantes con diferentes movilidades (azul de bromofenol y xileno cianol)
Marcador de pesos moleculares


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Gracias a un transiluminador UV, las moléculas de ADN pueden visualizarse. El marcador de talla permite analizar que la Eco RI ha cortado la molécula original de 10.000 bp en dos fragmentos, de 7.500 y 2.500 bp respectivamente.

 

(Podrás darte cuenta también que hace falta una técnica para conocer el orden de los trozos cortados)



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5. Isoschizomeros y familia de enzimas
Los isoschizomeros son enzimes que reconocen un mismo sitio, pero que no lo cortan en el mismo lugar, como Asp 718 y Kpn1.

Las familias de enzimas comprende enzimas que no reconocen necesariamente los mismos sitios, sino que producen extremos adhesivos iguales. Hay familias por ejemplo que producen extremos adhesivos GATC ó CTAG.

GATC: Sau3AI, BglI, BamHI, BclI et XhoII
CTAG: MaeI, SpeI, NheI, AvrI et XhaI

las figuras siguientes muestran cómo Sau3AI y BamH1 producen los mismos extremos:


6. Talla de los fragmentos de restricción:

 

Si los sitios de restrición fueran distribuidos al azar en la longitud de una molécula de ADN, una enzima que reconocería una secuencia de 4 nucleótidos, cortaría 1/256 nucleótidos, mientras queuna enzima que reconocería 6 nucleótidos cortaría en promedio 1/4.096 nucleótidos.



La digestión por EcoRI (secuencia de reconocimiento de 6 nucleótidos) de una molécula de ADN bacteriano de 4 millone s de pares de bases donará alrededor 10 +3 fragments diferentes, mientras que la digestión total de ADN de un mamífereo va a produicir alrededor de 10 +6 fragments.

Es por ésto que la frecuencia de aparición de un sitio depende de su secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, la enzima NotI que reconoce un sitio de 8 nucleótidos 5'-GCØGGCCGC-3' no corta mas de 3 del ADN de mamíferos: produce fragmentos de talla media de 1 a 1,5 milliones de pares de bases. Esta enzima se utiiza en los trabajos de cartografía física del ADN.


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7. RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP): polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción:
ejemplo: en el alele 2 abajo, el sitio rojo ha mutado, y el fragmento "a" obtenido por restricción no existe. Hace parte de un segmento más grADNe "b".



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Copyright © 2004 Cell Press. All rights reserved.
Molecular Cell, Vol 5, 889-895, May 2000

Short Article
Structure of BamHI Bound to Nonspecific DNA: A Model for DNA Sliding
Hector Viadiu 12 and Aneel K. Aggarwal 2¦
http://www.molecule.org/

1. Department of Biochemistry and, Molecular Biophysics, Columbia University, New York, New York 10032, USA
2. Structural Biology Program, Department of Physiology and Biophysics, Mount Sinai School of Medicine, New York, New York 10029, USA

Summary:
The central problem faced by DNA binding proteins is how to select the correct DNA sequence from the sea of nonspecific sequences in a cell. The problem is particularly acute for bacterial restriction enzymes because cleavage at an incorrect DNA site could be lethal. To understand the basis of this selectivity, we report here the crystal structure of endonuclease BamHI bound to noncognate DNA. We show that, despite only a single base pair change in the recognition sequence, the enzyme adopts an open configuration that is on the pathway between free and specifically bound forms of the enzyme. Surprisingly, the DNA drops out of the binding cleft with a total loss of base-specific and backbone contacts. Taken together, the structure provides a remarkable snapshot of an enzyme poised for linear diffusion (rather than cleavage) along the DNA.

Results:
We report here the structure of BamH I bound to a noncognate DNA sequence (GAATCC) that differs by only a single base pair from the cognate (G G ATCC) sequence. The structure reveals the enzyme in a distinct conformation that is incompetent for cleavage but competent for sliding.

BamHI Forms a Loose, Dynamic Complex with Nonspecific DNA
The noncognate DNA is accommodated loosely within a cleft at the bottom of the BamH I dimer . It protrudes out of the cleft, whereas, in the specific complex, the DNA is almost surrounded by the enzyme. The two-fold symmetry of BamH I coincides with the approximate two-fold axis of the DNA. However, compared to the specific complex, the enzyme is tilted about this axis by about 20°, resulting in markedly different DNA binding surfaces in the two complexes.

Moreover, in the nonspecific complex, the DNA binding cleft is widened by an outward symmetrical motion of the BamHI monomers (R and L), such that the distance across the cleft increases from 20 Å to 25 Å. Correspondingly, the buried solvent-accessible surface area decreases dramatically from 4350 Å2 to 1489 Å2 in going from the specific to the nonspecific structure. The DNA remains primarily B form (as in the specific complex), though it is substantially frayed at the ends. Remarkably, all of the base-specific interactions and DNA backbone contacts are lost.


 

 
BamH I Bound to Nonspecific DNA
The structure viewed down the DNA axis. The alpha helices are colored in green, the beta strands in purple, and the DNA in orange. Only one subunit is labeled. N and C mark the N and C termini of the protein.





Structures of free (A), nonspecific (B), and specific (C) DNA-bound forms of BamH I.
Regions that undergo local conformational changes are shown in yellow color. The enzyme becomes progressively more closed around the DNA as it goes from the nonspecific to the specific DNA binding mode. Residues 79­92 are unstructured in the free enzyme but become ordered in both the nonspecific and specific DNA complexes, albeit in different conformations. The C-terminal residues unwind in the specific complex to form partially disordered arms, whereas in the nonspecific complex they remain alpha helical

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biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
enzimas de restricción
Jean-Pierre HERVEG* y Maritza BARCIA-MACAY**
*Université de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.


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