Preguntas para el exámen:

1. ¿ Cuáles son las tres fases de la PCR?
2. ¿ Para qué hay una línea de base?
3. ¿ En cuántas partes se divide la fase ascendiente y por qué?
4. ¿ Cómo se verifica el rendimiento de la PCR?

 

5. ¿ Es fácil medir el rendimiento de la RT-PCR, por qué?
6. Discutir la utilización de los controles internos.
7. Explique las figuras 2, 4 y 5.
8. Los plásmidos de Entamoeba histolytica codifican el ARN de la pequeña subunidad del ribosoma. En los quistes de E. histolytica hay 4 núcleos. ¿ Es posible por la PCR de contar el número de plásmidos en una célula de Entamoeba?

Introducción


Es posible cuantificar la PCR clásica.
Para hacerlo, hay que estudiar la cinética de la PCR..
Hay que primero escoger bien los cebadores (primers). Deben ser específicos. No deben formar dimeros. La temperatura de annealing debe ser más grande que 60 ° C. La PCR debe comenzar con un "hot start".

Preparemos una cincuentena de tubos de PCR. Contienen la misma cosa: dos cebadores, Taq ADN pol, un ADN que hay que amplifiar, dNTPs y el tampón de reacción. Preparemos también una cincuentena de tubos controles que no contienen el ADN que hay que amplifiar. Coloquemos los tubos en un termociclador programado para efectuar la PCR. Después de cada ciclo, retiremos rápidamente un tubo prueba y un tubo control. Purifiquemos el ADN y leamos su densidad óptica a 260 nm. El gráfico, a la derecha, arriba, muestra el resultado obtenido. Una electroforesis de los productos formados aparece, a la derecha, abajo.


Hay tres fases:

1. Una línea de base. No hay bastante producto formado para ser leído por el fotometro o para aparecer en la electroforesis. El fotometro lee solamente el ruido de fondo.

2. Una fase ascendiente.
La fase ascendiente puede estar dividida en dos partes. Durante la primera parte, la cantidad de ADN debería doblar a cada ciclo (si el rendimiento de la reacción es 100 %). Durante la segunda parte, deja de doblar a cada ciclo. Así empieza el proceso que llegara a el plató.

3. Un plató.
El plató es debida a un agotamiento de los cebadores, un "agotamiento" del ADN pol y posiblemente también a la ley de Beer-Lambert.

La cuantificación de la PCR clásica y de la PCR en tiempo real miden el ADN sólo en el principio de la fase ascendiente, en las reacciones cuyo rendimiento es próximo del 100 %.

La cantidad de ADN formado dobla a cada ciclo antes de la segunda parte de la fase ascendiente. Esto puede ser verificado sólo más allá de la línea de base, sea tan pronto como la cantidad de producto ampliada es mesurable.

Esto puede ser verificado por una electroforesis en gel de agarosa:

Si después de n ciclos por ejemplo se formó 1 µg de ADN,

habrá:

1, 0.5, 0.25, 0.125 µg
después
n, n-1, n-2, n-3 ciclos 

 

Así como lo indica la figura de derecha.

Sometemos a la PCR las diluciones siguientes de la muestra inicial:

x, x/2, x/4,
Si el rendimiento de la reacción es del 100 %, debemos obtener después n ciclo, cantidades de productos proporcionales a la cantidad inicial (Línea verde, vertical en el gráfico de derecha).

Para obtener la misma cantidad de producto, hacen falta uno o dos ciclos más (línea horizontal, morena clara ).

De otro palabras, para verificar si el rendimenent es del 100 %, debemos verificar si la cantidad de ADN obtenida después n-1 ciclos es la misma que el obtenido cuando 1/2 del ADN inicial está sometido en n cyles. Para trabajar cuantitativamente, hay que trabajar en una zona dónde esta condición se verifica.

Para lal PCR, la mayoría de las veces, el rendimiento es próximo del 100 %.

En cambio, es imposible definirlo para el RT-PCR, porque no se puede verificar el rendimiento ni hasta la reproductibilidad de la transcripción inversa.

La referencia interna y la RT-PCR

Para comparar la expresión de un gen, en dos situaciones diferentes, utilizamos una referencia interna.

Por ejemplo, sobre la figura de la derecha, queremos medir la expresión de ATF3 cDNA en HCT116 células a 0, 4, 8 y 24 horas después un tratamiento con doxorubicin (DOX, 0.4 µg/ml), un agente genotóxico. Como control, utilizamos un segundo gen (beta-Actin) de el que suponemos que la expresión no es influida por el tratamiento.

Los resultados obtenidos implican dos cosas:
Qué la transcripción inversa sea reproductible (ni su rendimiento ni su reproducibilitad son conocidos).
Qué la expresión del control no sea modificada por el tratamiento (un agente genotóxico!).

Es importante repetir las experiencias, aunque la modificación es, como aquí, un aumento.

MAGE-1 expression threshold for the lysis of melanoma cell lines by specific cytolytic T lymphocytes.
Bernard Lethé, Pierre van der Bruggen, Francis Brasseur and Thierry Boon.
Melanoma Research 1997, 7 (suppl2) S83-S88.