plan:

1. Introducción
2. Las etapas de la reacción
..........a. Las amplificacions aritméticas y geométricas
..........b. Las ADN polimerasas
..........c. Los cebadores:
Los cebadores son tratados sólos, en un nuevo capítulo.
..........d. La duración de las fases y el número de ciclos.
..........e. La PCR en nido

3. El termociclador y el principio caliente (hot start)
4. La contaminación y el control negativo.
5. Evaluación del producto
6. Clonaje de produictos PCR: topoisomerasas
7. Algunas aplicaciones en la investigación

Cuestiones para el examen:


1. definir "cebador".
2. Explicar la palabra annealing
3. ¿ Cual es la extremidad del cébador que es alargada por la DNA pol?
4. Describa las 4 etapas de cada ciclo de la PCR
5. ¿ Cuáles son las diferencias entre la amplificación aritmética y geométrica?
6. ¿ Qué es una PCR "in silico"?

7. ¿ Cuáles son las diferencias entre la Taq polimerasa y la Pfu ADN
polymerasa?
8. ¿ Cómo detectar rápidamente una contaminación en la PCR?
9. ¿ Cómo limpiar una pipeta contaminada?
10. Explicar la nested PCR.
11. ¿ Es posible clonar los productos de PCR?
12. Describir las figuras del primer articulo sobre la PCR (1985)
13. ¿ Cómo se determina la duración de las fases en la PCR?
14. ¿ Cuando los ciclos de la PCR se terminan, es aconsejable de mantener el termociclador a 4°C?
15. ¿ A que velocidad trabaja laTaq ADN pol?

1. Introducción

 

La reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction, PCR) fue inventada por Kary Mullis en 1983 y le valió el Premio Nobel de Química en 1993.

dos cebadores (aquí azul y verde):
Esta técnica utiliza dos cebadores (oligonucleótidos) de unos 20 pares de bases de longitud, sintetizados por métodos químicos y cuyas secuencias corresponden a los extremos de las cadenas del ADN que se quiere reproducir.

El ADN que hay que multiplicar (aquí en negro):
El ADN que hay que multiplicar es calentado a 94° C: El calor separa las ambas cadenas. La temperatura es disminuida para alcanzar la temperatura de "annealing" por los cebadores. Entonces, cada cebador se fija (anneals to) a una sola cadena de ADN. En este momento interviene ADN pol.

El ADN pol:
El ADN pol Alarga la extremidad 3 ' de los cebadores utilizando dNTPs. Se forman dos cadena complementaria dando lugar a dobles cadenas de ADN. Este proceso repetido varias veces, reacción en cadena, permite obtener cantidades importantes del ADN original.

La temperatura de annealing debe ser medida. No es un valor teórico. Las altas temperaturas favorecen la especificidad del annealing. Para cada pareja de primers, hay que también medir la concentración effectice en ion Mg++.

La PCR es efectuado en termocicladores. Estos aparatos permiten cambiar rápidamente la temperatura de los tubos de reacción.

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primer: (cebador) Un nucléotide que se aparea a una de las extremidades 3 ' de la cadena de ADN que hay que clonar.
chain: cadena.
to anneal: aparearse a
dNTP: desoxinucleotid trifosfato

2. Las etapas de la reacción

 

La reacción en cadena de la polimerasa se desarrolla en cuatro pasos:

1. La fusión de ADN:

El primero es la separación total (fusión) de las dos cadenas que forman la molécula de ADN que se quiere amplificar. Para hacerlo nos calentamos La solución que contiene el ADN a 94 ° C. Ambas cadenas obtenidas servirán de plantilla a las reacciones que siguen.

2. Hibridación de los cebadores: "annealing"

Calculamos una " temperatura de base ", con la ayuda de una fórmula o de ábaco. Sometemos a un test luego la temperatura que hay que utilizar aumentando 3 en 3 grados el valor de base: para cada una de estos temperatura efectuamos un PCR. Escogido la temperatura que da más ADN. La temperatura óptima debe ser determinada con el termociclador que servirá luego.

3. Extensión de cebadores

El último paso consiste en la genración de la cadena de ADN complementaria por acción de la ADN polimerasa. Las ADN polimerasas han sido en su majoría aisladas de procariotas que viven en aguas termales, cuyas polimerasas son capáces de trabajar a temperaturas superiores a los 70°C. De esta manera sólo hay que añadir la enzima al inicio del proceso de la reacción.

Por costumbre, decidimos que ADN pol coloca 1000 nucléotidos por minuto. No sabemos cómo el número de cyles actúa sobre la enzima.

4. Los ciclos sucesivos

Los ciclos de denaturación, hibridación y sínthesis de ADN se repiten de numerosas formas. Los productos de cada ciclo de amplificación sirven de moldes matrices para el ciclo sucesivo, doblando el producto resultado en cada ciclo.

Los productos de la reación exponencial forman un segmento de ADN donde los extremos son definidos por la extremidades 5'. La longitud final depende del total de oligonucleótidos utilizados.

Nota:
A menudo hablamos de dimeros formados por los cebadores. Lo que se llama los dimeros muestran una longitud superior a la de dos cebadores (< 40 bp). La longitud de estos "dimeros" es bastante heterogéneos.

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plantilla, f: template.
termociclador: thermocycler.
Hay que someter a un test su thermociclador. Para eso, efectuamos el mismo amplificación en todos los pozos (pocillos)al mismo tiempo. Los productos obtenidos luego son examinados de (electroforesis). Las résultados obtenidos pueden variar según los pozos.

a. Las amplificaciones aritméticas y geométricas

 

La figure a la derecha muestra que los ciclos sucesivos producen segmentos de secuencias largas y cortas.

El número de las primeras secuencias es copiado de manera aritmética (1,2,3,4), mientras que los segmentos cortos son copiados de manera geométrica (1, 2, 4, 8, 16, 32....).

El producto de la reacción geométrica es un fragmento de ADN donde las extremidades 5' están marcadas por el final 5' de los dos cebadores.

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amplicons: Son las secuencias amplificadas. Los límites río arriba y bajo de un amplicon son las extremidades de los cebadores.
upstream: río arriba (5')
downstream: río abajo (3')
5' end: el final 5'
primers: cebadores

b. Las termo-estables ADN polimerasas

Para efectuar una PCR, se deben utilizar ADN polimerasas termo-estables. La Taq DNA pol por ejemplo fué aislada de la bacteria Thermus aquaticus que habita en medios acuáticos calientes de temperaturas de alrededor de 70°C. Esta polimerasa funciona de manera óptima a 72°C. La vida media de ésta enzima calentada a 96°C es de 40 minutos.
Tanto la hibridación como la síntesis de ADN se efectúan a temperaturas elevadas para evitar la formación de secuencias que no son complementarias.

La Taq DNA polimerasa posee una actividad 5'->3' polimerasa y 5'->3' exonucleasa, pero no tiene actividad exonucleasa 3'->5'. También posee una actividad terminal transferasa que ajusta un sólo nucleótido, con frecuencia una A, a las dos extremidades 3'-OH del fragmento amplificado. Esta abilidad es a menudo utilizada an los métodos de clonaje. Dos formas de Taq polimerasa son disponibles : una enzime nativa purificada de Thermus aquaticus y una enzima genéticamente producida en E. coli. Como la Taq I DNA polymerasa no tiene actividad exonucleasa 3'->5', no es capáz de eliminar los nucleótidos que no están correctamente insertados en la cadena que se forma.

El precio de la Taq ADN pol es muy elevado. Muchos laboratorios, hasta en los países muy ricos, preparan su Taq utilizando un plasmide que la codifica.

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half-life: la vida media

Los errores:
La Taq ADN pol es capáz de incorporar un nucleótido no apareado con una frecuencia de 2/10.000 nucleótidos por ciclo. La tasa de error observado después de 30 ciclos de amplificación es del orden de 0,25 %. Esto no constituye un verdadero problema cuando se efectúa un análisis global del producto PCR. De otra manera, la incorporación equivocada de nucleótidos sí es importante, especialmente si los fragmentos van a ser utilizados para clonaje. Es aún mas peligroso si la incorporación errónea se produce al comienzo de la amplificación.
Este problema se puede resolver parcialmente utilizando una mayor cantidad de ADN molde, osea la secuencia diana, al comienzo de la PCR, puesto que éntonces es posible también reducir el número de ciclos de amplificación y de la misma manera reducir el número de etapas de la síntesis del ADN.

Las ADN pol de las Archeas:
Otra manera de mejorar la técnica es la de utilizar Pfu ADN polimerasa purificada a partir de la archea Pyrococcus furiosus que habita a 100°C en sedimentos marinos geotérmicos. Esta enzima posee no solamente una actividad 5'->3' polimerasa, sino también actividad 3'->5' exonucleasa. Es la enzima que produce la tasa de error, la más baja conocida : es 4 veces más baja que la de la Taq ADN polimerasa. Su velocidad de polimerización (550 nucléotides/min) es menos elevada que la de la Taq ADN polimerasa (2.800 nucléotides/min). Como ésta no tiene actividad terminal transferasa, produce productos PCR con extremidades cortas.

d. La duración de las fases y el número de ciclos.


Los termocicladores no son unas máquinas perfectas. Les hace falta un cierto tiempo para modificar su temperatura. Los tiempos son pues también unos datos experimentales. No hay que reproducir los tiempos de una publicación: hay que verificarlos sobre nuestro termiciclador

Contamos que el ADN pol añade 1000 nt por minuto. Si el amplicon contiene muchos A y T, hace falta de un a dos minutos por el annealing.

Después del PCR, muchos autores aumentan de 10 minutos el tiempo de elongación.

Un gran número de ciclos permite detectar moléculas muchas raras. Así, 50 ciclo multiplica el número de molécula por 10.000.000.000.

Cuando la PCR se acaba, es malo para el aparato de mantener una temperatura de 4 ° C. Los tubos son tapados y el PCR les esterilizó. Mantenerlos una noche a temperatura ambiente no les hace ninguno daño.

e. La PCR en nido (nested PCR)

La amplificación de secuencias de ADN no se realiza indefinidamente sino que tiene un fin determinado. Pasados los 25 a 30 ciclos de amplificación, la cantidad de la ADN polimerasa disponible deviene limitada si se desea amplificar más de 106

Lo mejor es de diluir el producto de la primera amplificación 1.000 a 10.000 veces y de recomenzar una nueva amplificación utilizando nuevos pares de cebadores con secuencias comprendidas en el primer resultado de la amplificación. Se puede entonces incrementar el rendimiento a niveles entre 109 a 1010. La utilización de dos juegos de cebadores, que se denominan cebadores anidados (« nested primers »), permite reduicir significativemente el riesgo amplificar una secuencia indeseada cuADNo se efectúan un número elevado de ciclos, en la PCR en nido.

3. El termociclador y el principio caliente (hot start)

Es una máquina que se puede programar para obtener resultados a diferentes temperaturas y tiempos, según se desee. Una vez que los reactivos son introducidos, la reacción se desarrolla sin ninguna intervención manual.

Hay termocicladores a tapaderas calentantes. En éstos, los diferentes ciclos no producen evaporación de la mezcla. En otro termocicladores, evitamos la evaporación colocando una gota de aceite mineral sobre la mezcla de los reactivos.

Hay también termocicladores que permite realizar varios programas al mismo tiempo y otros que permiten trabajar en temperaturas diferentes.

Para evitar contaminar su termociclador, jamás abra tubos después de PCR en la cuarto dónde él se encuentra.

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thermocycler: termociclador.
mineral oil: aceite mineral

Principio caliente (hot start)


Los "hot starts" son unos métodos que permiten comenzar un PCR sólo cuando la temperatura de annealing padeció. Comenzar la PCR antes de que esta temperatura padezca acaba en la producción de productos no específicos porque los cebadores pueden aparearse dondequiera por debajo de esta temperatura.

Hay hot starts comercial, muy costoso, pero muy eficaz, en el cual la Taq DNA pol es libèrée a 94 ° C. Basta con comenzarle el programa por dos o cuatro minutos a 94 ° C. La temperatura baja 9'4°, a la temperatura de annealing.

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mismatch (to): emparejar mal

He aquí el "hot start del pobre". Colocamos todos los reactivos a 0 ° C sobre una mezcla hielo / agua. A esta temperatura, Taq DNA pol es inactivo. Preparamos las mezclas a esta temperatura. Programamos el termociclador, comenzando con 4 minutos a 96°C. Colocamos los tubos directamente del hielo/agua a 96 ° C. Luego empiezan los ciclos sucesivos. El método no es perfecta, pero mejora los resultados.

La temperatura de los tubos no alcanza instantáneamente 95 °. Un hibridation a lugar durante este intervalo, tan corto sea. Durante este intervalo, Taq DNA pol alarga el cebadores mal apareado

4. La contaminación y el control negativo.

La PCR multiplica las moléculas raras. En un cuarto donde estas moléculas no existían, la PCR las devuelve muy abundante.

Descorchar un tubo de PCR para hacer un electroforesis basta con contaminar una cuarto. La rutina clínica es una fuente de contaminación. Es prudente trabajar por lo menos en dos cámaras. Una cámara para preparar la PCR y una cámara para analizar los resultados. Las pipetas jamás deben ir de una cámara al otro.

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RNase free: sin RNasa

En caso de contaminación, hay que tirar a la basura todos los reactivos independemente del precio. Limpiamos las pipetas aspirando luego rechazando hypochlorite sin sobrepasar la punta, para no estropear el mecanismo de la pipeta. Enjuaguemos luego con agua destilada, RNase free..

Para descubrir seguidamente las contaminaciones, hay que siempre preparar un control negativo: todos los réactivos salvo el ADN que hay que amplifiar.

6. Evaluación del producto

La talla del producto PCR se evalúa luego mediante la utilización de electroforésis en un gel de agarosa, coloreado con bromuro de etidio. Genralmente la talla de los fragmentos se sitúa alrededor de 0,2 a 2 kb, pero pueden llegar a 15 kb.

Si la secuencia a amplificar se conoce, se puede verificar que la talla del producto PCR total corresponda a las talla calculada. Se puede también verificar , mediante la digestión del producto PCR y con enzimas de restricción, que los sitios de restricción se encuentran en el lugar previsto luego del secuencaje.
Aún si ésto demanda un trabajo suplementario, es a menudo más prudente verificar la especificidad de los cebadores utilizados mediante el secuencaje de los productos obtenidos (ciertas firmas no preparan bien estos) .
Para el secuencaje, los fragmentos de doble hélice del ADN obtenidos deben ser primeramente purificados en una columna de exclusión para así eliminar los nucleótidos y los dos oligonucleótidos empleados durante la amplificación PCR.

Para la PCR, se usa a menudo el ADN genómico total extraído de células. Este ADN se obtiene metiendo las células a hervir directamente, seguidas de la PCR sin etapas de purificación. Se pueden amplificar secuencias de ADN provenientes de los más remotos ejemplares, por ejemplo manchas de sangre seca por años, animales desecados, pieles conservadas en museos, plantas secas ó incluso momias de miles de años. Estas moléculas son sin embargo a menudo degradadas y compuestas de solo pequeñas cantidades de ADN muy corto., de talla media pequeña: Un ADN extraído de momia de 4000 años y clonado después solo ha rendido 90 pares de bases. Además el ADN humano puede contaminarse con el ADN bacteriano.

Como la PCR es capáz de amplificar no sólo una sola molécula d'ADN, se debe prestar mucha atención a la contaminación, pués trazas de ADN extrañas podrían ser por error copiadas.

Minúsculos volumenes como gotas de aérosol provenientes de una micropipeta pueden contener un número importante de fragmentos listos a ser copiados. Lo ideal sería de tener un juego de pipetas sólo reservados para PCR, usar guantes, guardar bien los reactivos y de hacerles controles de calidad PCR regularmente con todos los componentes salvo el ADN.

7. Clonaje de los produictos PCR: topoisomerasa

 

Para clonar los productos PCR, se puede utilizar la ADN topoisomerasa I, una enzima que corta y enrolla-desenrolla ADN al curso de su replicación. La topoisomerasa separa las hebras de ADN, permitiendo a la hebra saparada de desenrollarse alrededor del eje de la hebra no separada. La enzima suelda entonces las extremidades de la hebra separada y desprendida de ADN.

Su funcionamiento se parece a la véz como de enzima de restricción y a la vez como de ligasa. La topoisomerasa I del virus Vaccinia reconoce la secuencia 5'-(C/T)CCTT-3' en una hebra doble de ADN, y se une de manera covalente a un 3'-fosfato de la tiamina situado al final de ésta secuencia.

 

La secuencia de reconocimiento de la topoisomerasa se coloca en cada extremidad de un plásmido linearizado. CuADNo el vector es mezclado con la topoisomerasa, la enzima se une de manera covalente al extremo 3'-fosfato del extremo del vector. Esta acción protégé al vector linearizado de su degradación por exonucléasas y su religado. Se obtiene así un vector activado por la topoisomerasa. Los productos PCR que carecen de extremidad 5'-fosfato sirven de substrato por la enzima y son unidos al vector por la topoisomerasa en 5 minutos a la temperatura ambiente

8. Algunas aplicaciones en la investigación

a. Obtención de secuencias específicas a partir de ADN clonado

Es muy práctico utilizar la PCR para preparar ADN de un fragmento clonado en un plasmido ó un fago. Es suficiente provisionarse de los nucleótidos complementarios a las secuencias del vector de un lado y del otro del fragmento a clonar. En el vector pGEM-3Z que se presenta a continuación, debe elejirse como primer sentido el complemento del promotor de T7, y la secuencia del promotor SP6 como primer antisentido.

b. Analísis de mutacions

La PCR puede adaptarse para poner en evidencia y analizar mutaciones que pueden sucederse en las células eucariotas. Estas mutacions pueden ser ocasionadas debidoa errores, ya sea insertos o elevamiento de insertos, ó reemplazo de nucleótidos por otros (mutaciones puntuales). Estudios pueden realizarse a partir de material aislado de una sóla célula. Substracciones y adiciones pueden ser determinados mediante la cuantificación de la talla final del producto amplificado. Si se quiere analizar una mutación puntual, se debe realizar un secuencaje del producto PCR, puesto que éstas mutaciones no cambian lel tamaño del producto obtenido.

c. adición de secuencias útiles

Se puede también añadir secuencias útiles, que contengan por ejemplo uno más sitios de restricción, a las extremidades de los fragmentos amplificados. Será suficiente de introducir secuencias suplementarias en el lado 5' de los oligonucleótides elejidos para realizar la PCR.