biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
Las bacterias y Escherichia coli (E. coli)
Jean-Pierre HERVEG*
*Université Catholique de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.

Ir a: http://www.answers.com/topic/escherichia-coli

introducción:

1. morfología

Las bacterias son procariotas: no poseen núcleo, es decir que la replicación, la transcripción y la traducción ocurren en el mismo compartimento. En las eucariotas, estos dos mecanismos son separados por la pared nuclear. En procariotas ambos procesos ocurren en el mismo compartimento. En la célula bacteriana vemos:

En el centro del citoplasmo, hay un nucleoido que contiene el ADN genóforo, generalmente circular y no asociado a histonas ni a ninguna proteína básica de la célula bacteriana. Sin embargo, las eubacterias tienen una proteína del tipo de las histonas, denominada HU en Escherichia coli. El ADN está unido a la membrana celular durante la replicación y la separación. En ciertas bacterias, hay además plásmidos, o pequeños ADN circular. A veces encontramos inclusiones citoplasmicos.

El mesosomo es una pequeña invaginación de la membrana plasmática donde se realiza la síntesis del ATP. El mesosomo contene también las ADN-polimerasas util durante la replicación.

Ciertas bacterias muestran flagelos, otros pilis. Los pilis son tubos abundantes y cortos. Un flagelo es siempre asociado con un corpúsculo basal. un pili puede servir para el paso de ADN de una célula a otra.

Poseen ARN y ribosomas característicos, para la síntesis de proteinas.

La pared celular es rígida y es hacha con moléculas exclusivas de bacterias.
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NB:
Escherichia coli (Theodor von Escherich*) es una bacteria de la flora intestinal. La mayor parte de especie es beneficiosa. Exista sin embargo unas especies patógenas que liberan enterotoxinas.
E. coli es un bacilo Gram -.
*http://www.whonamedit.com/doctor.cfm/1436.html
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/
Chap3.html#Bacterial_morphology

introduction:

1. morphology


Bacterias are prokaryotes: they miss a nucleus. Replication, transcription and translation take place in the same compartment. In eukaryotes, replication and transcription are separated by the nuclear wall. In prokaryotes both processes take place in the same compartment. Bacterial cells show:

In the center of the cytoplasm, the nucleoid is a region which contains the genomic (here we should use genophoric instead) DNA (usually one cicular molecule). This DNA is not associated to histonas nor to any basic bacterial proteins. However, the eubacterias have a protein of the histona type, which is called HU in Escherichia coli.The DNA is joined to the membrana celular during the replicación and the cell separation. other bacteria, we could found plasmids and cytoplasmic inclusions.

Mesosom is a small cytoplasmic invagination of the plasma membrane where ATP is synthetized and which contains the DNA pols for replication.

Some bacterias show flagels, other, pilis. Pilis are numerous and short tubes. A Flagel is associated with a basal granule. A pili can carry the DNA from one cell to the other.

They have ARN and ribosmes for protein synthesis.

The cell wall is rigid and made of molecules typical of bacterias.



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NB:
Escherichia coli (Theodor von Escherich*) is a bacterium of the intestinal flora. Most species are beneficial. A few pathogenic species exist nevertheless that liberate enterotoxinas.
E. coli
is a bacillus Gram -.
*http://www.whonamedit.com/doctor.cfm/1436.html
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/
Chap3.html#Bacterial_morphology

   





2. reproducción

La reproducción en las bacterias es sexual o asexuada. La reproducción sexual es un cambio de ADN entre dos células bacteriales seguido de una modificación del ADN de la bacteria receptora. Para una bacteria hay tres modos de cambiar el ADN:

Transformación: una bacteria toma el ADN directamente de bacterias muertas. El ADN entra en la célula después de que un agujero había sido hecho a traves de la pared y de la membrana de la célula. Un proceso similar en eucariotas se llama transfeción (salvo en la levadura donde se llama también transformación). La transformación es un método utilisado para introducir experimentalmente el ADN dentro de las bacterias y levaduras.

Conjugación y sexducción: suponiendo que tenemos una bacteria que contiene un plásmido F (tal bacteria es llamada F +). Esta bacteria es capaz de construir un pilus. El plásmido F posee los 25 genes necesarios para hacer un pilus. El pilus permite a la bacteria comunicar con otras bacterias que no poseen el plásmido (" F-"). El cambio de ADN es hecho a traves del pilus. Si el plásmido es integrado en el genóforo bacterial (la bacteria se llama entonces HFr), todo o una parte del genóforo puede pasar por el pilus (sexducción).

Transducción: La transmición de ADN de una bacteria a la otra es hecha con la ayuda de una infección con un virus de bacteria (bacteriofago). Este virus se comporta como un vector. Este método también es usado con células eucariotas.

En cualquier caso, la transmisión de ADN es llimited por la restricción, un mecanismo que protege células de la introducción de ADN extranjero.


2. reproduction


Reproduction in bacteria is either sexual or asexual. Sexual reproduction is an exchange of DNA between two bacterial cells followed by a modification of the DNA of the recipient bacterium. For a bacterium there are three ways to exchange DNA:

Transformation: a bacterium takes up DNA directly from surrounding dead bacteria. DNA enters the cell after a hole had been made through the cell membrane. A similar process in eucariotas is called transfection (except in yeast where the process is also called transformation). Transformation is also a method used frequently in the laboratory to introduce experimentally DNA inside bacterias and yeast.

Conjugation and sexduction: A bacterium contains a plasmid F (such a bacterium is called F+). This bacterium is able to build a pilus. The pilus allow the bacterium to communicate with another bacteria which doesn't possess the plasmid (such a bacterium is called F-). The exchange of DNA is made through the pilus. If the plasmid is integrated into the bacterial chromosme (bacterium HFr), the whole or a part of the chomosome could pass through the pilus (sexduction).

Transduction: The DNA transfer is made from one bacteria to the other with the help of a virus (bacteriophage) infection. This virus behave as a vector. This method is also used with eucaryotes cells.

In any case,transmission is llimited by restriction, a mechanism which protects cells from the introduction of foreign D


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El plásmido F contiene 25 genes que controlan y producen los pilis.



3. la restricción:

Fue notado que un fago (virus bacterial o bacteriofago) que parasita a una especie de E. coli es destruido cuando esto entra en una bacteria de una otra especie: se dice que este phage es "restringido" en una cepa determinada. Las otras cepas de bacterias producen una endonucleasa que corta el ADN del fago que no fue metilado por un metilasa específica de estas bacterias. La restricción es producida por una pareja de enzimas: un metilasa y un endonucleasa. La metilasa y la endonucleasa reconocen un mismo sitio, el sitio de restricción.

las enzimas de restricción de tipo II:
En biología molecular, se utilizan sobre todo las endonucleasa de tipo II. La metilasa de tipo II pone un metilo sobre un nucleotido del sitio (Adenina o Citosina). Esta metilación protege este sitio: en effecto, la endonucleasa de typo II corta los sitios no metilados. Así, todo ADN extranjero, que se introduce, es cortado por la endonuclease. En cambio, el ADN producido en la bacteria (clonación) no puede ser cortado por el endonucleasa de la pareja. Estas dos conclusiones son importantes para la biología molecular.

Por ejemplo, las endonucleasas isoschizomeras Msp I y Hpa II reconocen la misma secuencia (sitio de restricción): CCGG.
Msp I es sensible solamente a la metilación del carbono 5 de cytosine externa (m5CCGG). Hpa II es sensible a la metilación del carbon 5 de ambas cytosinas (Cm5CGG, m5CCGG o m5Cm5CGG).

las metilasas menos specificas
Existe además metilasas menos specificas, pero más general, como dam y dcm. Usted tiene que conocerlos.

dam
La metilasa dam pone un metilo sobre el nitrógeno 6 (m6N) del adénine en la secuencia GATC. El ADN listo a partir de células dam + contendrá Gm6ATC y no será cortando por enzimas bloqueadas por este modo de metilación (Mbo I).

dcm
Las metilasas dcm ponen un metilo sobre el carbono 5 del citosina (m5) en la secuencia CCAGG o CCTGG. El ADN listo a partir de células dcm + contendrá Cm5(A/T)GG y no será cortando por enzimas bloqueadas por este modelo de metilación (Bst OI).

Cómo hacer en práctica:
Si nuestro sitio de reconocimiento no contiene todo o la parte de la secuencia GATC o de la secuencia CC (A/T) GG, será insensible la metilación por dam y dcm.
Las enzimas que reconocen estas secuencias tienen una sensibilidad variable en el methylation. Mbo I (sitio: GATC) y Bam H I (sitio: GGATCC) contenen el sitio dam. Mbo I es inhibido y Bam HI no.

restricción y la transformación experimentale
Para la transformación, hay que escoger una cepa de bacteria que no destruyen (por restricción) la secuencia que hay que introducir. Un problema común ocurre cuando ADN de eucariotas, metilado en CG, es introducido en un E. coli con un sistema de restricción Mcr: esto cortará el ADN metilado. La restricción limita también la transmisión del plasmide R (resistencia a los antibióticos) de bacterias a bacterias.

3. restriction:

It was noticed that when a phage (bacterial virus or bacteriophage) which parasites one species of E. coli enters in a bacterium of an other species, it is destroyed: it is said that this phage is "restricted". The other species produce an endonuclease which cut the DNA of the phage which was not methylated by a methylase specific of these other bacteria. The restriction process is produced by a couple of enzymes: a methylase and an endonuclease.
The methylase and the endonuclease recognize the same site, called the site of restriction.

type II restriction enzymes
In molecular biology, type II endonucleases are widely used. The type II methylase puts a methyl on a nucleotido (A or C) of the site. This ethylation protects this site: indeed, the endonuclease of the same couple cuts the unmethylated sites. Any foreign DNA, which is introduced inside the bacterium, is cut by the endonuclease, because it is not methylated at the right place. Any DNA produced in this bacterium (cloning) cannot be cut by the endonuclease of the couple. These two conclusions are important in molecular biology.

For example, the isoschizomeros Msp I and Hpa II recognize the same sequence (site of restriction): CCGG.
Msp I is sensitive only to the methylation of the carbon 5 of the external cytosine (m5CCGG). Hpa II is sensitive to the methylation of both cytosines (Cm5CGG, m5CCGG o m5Cm5CGG).

less specific methylases:
Many bacterium exoress less specific methylases like dam and dcm. You have to know them

dam
dam methylases put a methyl on the nitrogen 6 (m6N) of the molecule of adenin when located in the sequence GATC. The ADN produced and extracted from a dam + bacteria cannot be cut by an endonuclease recognizing a site containing this sequence (Mbo I).

dcm
dcm methylases put a methyl on the carbon 5 (m5) of the molecule of cytosine located in the sequences CCAGG or CCTGG. The ADN produced and extracted from a dcm + bacteria cannot be cut by an endonuclease recognizing a site containing this sequence (Bst O1).

What to do in practice:
If our recognition site does not contain all or a part the sequences (GATC) and (CC (A/T) GG), there will be no problem.
But:
The enzymes which recognize these sequences have a variable sensibility to methylation. Mbo I (sitio: GATC) and Bam H I (sitio: GGATCC) contain the site dam. Mbo is inhibited and BamH is no.

Restriction and experimental transformation
Transformation requires a bacteria that doesn't destroy, by restriction, the DNA which is introduced. In eukaryotes, the DNA is often methylated on CG. When such a DNA is introduced in bacteria expressing the restriction system Mcr, it is cut into pieces because the Mcr system cut the DNA which is methylated. Restriction limit also the transmission of the R plasmid wich communicate the antibiotic resistence.

4. Alpha complementación

El LacZ gen codifica un polipéptido de 1029 aminoácidos. Este polipéptido forma un tetramero. Sólo este tetramero es una enzima functional. Esta Polimerización depende de la presencia de 50 primeros aminoácidos (la región N-Terminal). La supresión de los 50 primeros aminoácidos genera un péptido (el péptido de Omega o delta M15 gen) que es incapaz a polimerisar y no muestra la actividad enzymatic.

No obstante, si se abastece la secuencia que codifica el péptido faltante (llamado el péptido alfa), el peptide omega se vuelve functional. Aunque si esta secuencia es llevada por un plásmido.
Llaman la complementación alfa al fenómeno. Cepes de E. coli constitutivamente expresan unicamente el péptido Omega. Ellos no muestran ninguna actividad enzimatica. Cuando una bacteria de tal especie es transformada con un plásmido capaz de realizar la complementación alfa, el enzimatic acitvidad es devuelta.

Alpha complementation of LacZ in mammalian cells
Peter Moosmann and Sandro Rusconi
Nucleic Acids Research, 1996, Volume 24, Number 6, Pp. 1171-117

La parte amino-terminal del gene lacZ que produce la parte "alfa" de beta-galactosidase ha sido incorporada en plásmido R. Las bacterias transformadas por este plásmido R son resistentes al antibiótico y hacen la complementación alfa. Verificamos el complémentation incubando las bacterias con un substrato sintético: X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D- galactoside). Cuando hay complementation, X-gal es hydrolisada. El producto de hidrólisis es azul. Colorea bacterias y las colonias en azul.

Si la secuencia que codifica el peptide alfa no es completa, el complémentation no se hace y las colonias quedan blancas.

Se colocamos el sitio de inserción (polylinker) en esta secuencia. Si un gen es insertado, la secuencia es interrumpida y la colonia es blanca. Las colonias azules son las que tienen un plasmide sin insert.
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL4900/FMBplasmids.html

4. Alpha complementation

The LacZ ([beta]-gal) product is a polypeptide of 1029 amino acids. It gives rise to the functional enzyme after tetramerization. Tetramerization depends on the presence of the 50 first resisdues (N-terminal region). Deletion of the N-terminal sequence generates a peptide (omega peptide) that is unable to tetramerize and does not display enzymatic activity.

The activity of the omega peptide can be fully restored either in bacteria or in vitro if a small fragment (called alpha peptide) corresponding to the intact N-terminal portion of the [beta]-gal is added in trans . The phenomenon is called alpha complementation and the small N-terminal peptide is called alpha peptide. Special strains are produced that constitutively express omega peptide. They don't express enzymatic activity. They can be transformed by plasmids able to perform alpha complementation. This transformation restore the missing activity.

Alpha complementation of LacZ in mammalian cells
Peter Moosmann and Sandro Rusconi
Nucleic Acids Research, Volume 24, Number 6, Pp. 1171-117

Histochemical identification of recombinant clones
The amino-terminal part of the lacZ gene which produces the "alpha" part of beta-galactosidase has been incorporated into R plasmids. Bacteria transformed by this plasmid are résistant to the anitbiotic and perform the alpha complementation. Complementation is verified by cutivating bacterias with X-gal
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D- galactoside). When complementation takes place, colony is blue.

Insertion of cloned DNA into the truncated 5' region of lacZ gene abolishes this alpha complementation and produce white colony in the presence of X-gal.

Commercial plasmids have an insertion site (polylinkerintide the lacZ region.


http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL4900/FMBplasmids.html



5. los operones:

El ADN de los procariotas es organizado en grupos de genes. Tal grupo es llamado un operon. Todos los genes de un operon participan en la misma función. En la eucariotas, algunos protistos tienen operones (tripanosomas). En ese caso, los genos de un operon no participan necesariamente en la misma función.
Ejemplo:
Los genes del opéron thr permiten la síntesis del treonina (thr) cuando este aminoácido no está en el medio de cultura.
5. operons

The ADN of the procaryotes is organized in groups of genes. Such a group is called an operon. All the genes of an operon take part in the same function. In the eucariotas, some protists have operons (trypanosomes). In this case, the genes of a given operon usually do not take part in the same function.
Example:
The genes of the operon thr allow the synthesis of the threonine (thr) when this amino acid is not in the culture medium.

 


Un operón consiste en:

el sitio de inicio de la transcripción (el promotor)
un operador que controla el acceso de la ARN pol al promotor
un gen regulador que codifica una proteína que se ata al operador. La proteína, una vez atada, está de través del camino de ARN pol: así la transcripción está bloqueada.

La proteína reguladora directamente puede atarse al operador o se lo ata cuando es atada él misma a un represor.

Entonces viene las secuencias que codifican los genes del operón. Cada secuencia es separada del siguiente por una señal de terminación. La transcripción producirá un solo mRNA. La traducción producirá cada una de las proteínas codificadas de este mRNA solo.

An operon consists in:

The start site of transcription (the promoter)
an operator that controls the access of the RNA pol to the promoter
a regulatory gene that codifies a protein that sticks to the operator. The protein, once tied, the the forward move of the RNA pol: the transcription is blocked.

The regulatory protein can directly stick to the operator or only after having fixed the represor.

Then comes the sequences coding the genes of the operon. Every sequence is separated from the following one by a termination signal. The transcription will produce a unic mRNA. The translation will produce each of the codified proteins from this mRNA.


Los promotores regulables son unos promotores que actúan cuando lo decidimos

 



Los operones son inducibles, reprimibles o constitutivos. En Escherichia coli se identificaron setenta y cinco operones diferentes que controlan 250 genes estructurales.

Los operones inducibles son expresados sólo cuando los genes que contienen son necesarios. El ejemplo clásico es el operón lactose. La lactosa no está habitualmente presente en el medio de cultura de E. coli. La bacteria economiza pues la expresión de los genes de este operon. Pero, cuando hay lactosa, el operón es inducido y el lactosa está utilisando.

Los operones represibles son habitualmente exprimidos, pero cuando su expresións no son necesarias más, son reprimidos. El operón trp no es exprimido si hay triptofano en el medio de cultura.

En ambos casos, la secuencia del operador puede fijar la proteína reguladora. En el inducibles operones esta proteína es atado sólo cuando el inductor es ausente. En el repressible operons la proteína reguladora es atado cuando el represor está presente

Los operones constitutivos son aquellos operones que siempre se expresan, y por lo tanto no están regulados ni por inductores ni por represores.

The operons are inducibles, reprimibles or constitutive. In Escherichia coli seventy five operons were identified. They control 250 different structural genes.

Inducible operons are expressed only when the genes that they contain are necessary. The classic example is the operon lactose. Lactose is not usually present in the culture medium of E. coli. The bacterium economizes the expression of the genes of this operon. But if lactose is present, the operon is induced and the lactose is used as a metabolite.

Repressible operons are habitually expressed, but they are repressed when they are not necessary. The operón trp is not expressed if there is no triptofano in the culture medium.

In both cases, the operator sequence can fix the regulatory protein. In the inducibles operons this protein is bound only when the inductor is absent. In the repressible operons the regulatory protein is bound when the repressor is present

Constitutive operons are those operons that always express, and therefore they are regulated neither by inductors nor for repressors.


Operones inducibles, ejemplo: el operón lactosa (lac).

La lactosa, el azúcar de la leche, es hidrolizada por la enzima ß-galactosidasa. Esta enzima es inducible: solo se produce en grandes cantidades cuando la lactosa esta presente.

Cuando no hay lactosa en el medio, la proteína represora (i) se encuentra unida al operador (o) impidiendo la transcripción de los genes para las enzimas z, y y a. Cuando hay lactosa en el medio (intestinos de un mamífero durante la lactancia), ésta funciona como inductor, se une a "i" cambiando su forma lo que evita que se pueda unir al operador, de este modo la polimerasa puede transcribir los genes correspondientes.

Se ha visto que el operón lac tiene de hecho tres secuencias de tipo operador. La denominada O1 es la "clásica", parcialmente superpuesta con el promotor, pero también hay que contar con la O2, centrada hacia la coordenada +440 del ARNm, y la O3, bastante aguas arriba respecto del promotor (centrada hacia -82). Se ha propuesto que los tetrámeros del represor reconocen simultáneamente dos de estas secuencias, obligando al ADN a curvarse de modo pronunciado, evitando así que pueda actuar la ARN-polimerasa.
Gen lac-z : codifica la ß-galactosidasa (tetrámero de un polipéptido de 116 kDa) hidroliza la lactosa en galactosa y glucosa;
Gen lac-y determina la ß-galactósido permeasa (46 kDa); proteína de membrana que realiza el simporte de H+ y lactosa.
Gen lac-a: determina ß-galactósido acetilasa, prescindible y de papel desconocido.



6. promotores regulables


Los promotores regulables son unos promotores que actúan cuando lo decidimos. Insertamos un gen que codifica una proteína de interés en un vector. Colocamos a un promotor regulable delante de este gen.

En efecto, la producción de proteínas extrañas puede ser tóxica para la bacteria. Comenzamos por permitir la multiplicación de las bacterias. Luego, cuando hay bastantes bacterias, se añade un inductor. Éste actúa al promotor: la proteína de interés es producida. Cuando la cantidad de proteínas producida se vuelve tóxica, se para la acción del inductor.

El elemento que controla el operon lac
Hacemos producir, por la bacteria o por el vector la proteína "i". Colocamos al promotor y el operador de lac delante del gen insertado. El promotor puede funcionar sólo cuando se añade a IPTG en medio de cultura.

El elemento que controla el operon trp
El operon trp permite la síntesis de tryptófano. Cuando hay tryptófano en el medio este operon es reprimido. Colocamos el elemento de controle de trp delante del gen que hay que controlar. El gen no es expresado si hay tryptófano o su equivalente (ácido 3-indol-acrílico) en el medio.

El promotor híbrido tac
El promotor tac combina la región ­35 del promotor trp y la ­10 del promotor lac. Es un promotor híbrido. Este promotor es inducido por IPTG y reprimido por la glucosa.

Promotor termosensible
Se puede utilizar el promotor Pl del phage lambda y su represor mutando CIm. Cim es thermosensible, es decir que es destruido a 42°C. A 30 ° Clm es estable y el promotor Pl es inhibido. A 42 °, el inhibidor es destruido y el promotor trabaja bien.

Promotor del fago T7
El promotor de fago T7 únicamente funciona con la ARN pol de este fago. En el genoforo de la bacteria, insertamos el gen de ARN pol T7 controlado por el elemento de control de lac (Con el gen de la proteína " i " y el operador, Ver más alto). Para expresar el gen controlado por el promotor de T7, hay que añadir a IPTG en el medio.
6. adjustable promoters


The adjustable promoters are promoters acting only when we decide they should. We insert a gene coding a protein of interest in a vector. We place an adjustable promoteur in front of this gene.

Indeed, the production of foreign proteins can be toxic for the bacterium. We begin by allowing the reproduction of bacteria. Then, when there are enough bacteria, we add an inductor. This one acts on the promoter: the protein of interest is produced. When the amount of produced proteins becomes toxic, we stop the action of the inductor.

The element which controls the operon lac
We make produce by the bacterium or by the vector the protein "i". We place the promoter and the operator of lac in front of the inserted gene. The promoter works only when IPTG is added to the culture medium.

The element which controls the operon trp.
The operon trp allows the synthesis of tryptophane. When there is tryptophane in the medium this opéron is repressed. We place the element of controle of trp in front of the gene to be controlled. The gene is not expressed if there is of the tryptophane or its equivalent (acid 3-indol-acrilic) in the medium.

The hybrid promoter tac
The promoter tac combines the region-35 of the promoter trp and-10 of the promoter lac. He is a hybrid promoter. This promoter is nduced by IPTG and repressed by the glucose.

Promoter thermosensible
It is possible to use the promoter Pl of the phage lambda and its mutated repressor CIm. Cim is thermosensible, that is to say that is destroyed to 42°CAt 30° Clm is stable and the promoter Pl is inhibited. At 42 °, the inhibitor is destroyed and the promoter works perfectly well.

Promoter of the phage T7
El promotor de fago T7 únicamente funciona con la ARN pol de este fago. En el genoforo de la bacteria, insertamos el gen de ARN pol T7 controlado por el elemento de control de lac (Con el gen de la proteína " i " y el operador, Ver más alto). Para expresar el gen controlado por el promotor de T7, hay que añadir a IPTG en el medio.








Un ejemplo de plásmido de expresión de alta eficiencia

El plásmido pPLc2833 era ya un buen plásmido de expresión, pero vamos a ver cómo, a partir de él, se construyó otro aún mejor.

El pPLc2833 cuenta con un módulo pensado para clonar genes bajo el control del promotor PL del fago l: tras el PL existe un polilinker, es decir, un trecho de ADN dotado de múltiples dianas únicas para las respectivas enzimas de restricción (lo que permite usar cada vez la enzima más adecuada a nuestro experimento). Este plásmido presenta unas 40 copias por cromosoma. Para lograr una expresión a mayor nivel, se sustituyó su origen de replicación por el origen de replicación de otro plásmido, llamado pKN402, de modo que el número de copias se puede aumentar unas 8 veces incubando la bacteria a 42ºC. De esta forma se obtuvo el plásmido mejorado pCP3. Para su uso correcto, las células que albergan derivados de pCP3 con genes clonados bajo el promotor PL se cultivan primero a 28ºC, y una vez alcanzada una buena densidad, la temperatura se sube hasta 42ºC, con lo que el número de copias sube hasta unas 700. A esa temperatura, el represor termosensible cI(ts) se inactiva, por lo que el promotor PL funciona a su máximo rendimiento, y se logran altos niveles de la proteína codificada por el gen clonado.

Para hacerse una idea de la eficiencia de este sistema de expresión, baste decir que cuando se clonó el gen de la ligasa de T4 en el pCP3, nada menos que el 20% de la proteína total a 42ºC era ligasa de T4. (A título comparativo, la proteína "natural" más abundante de E. coli supone el 2% de la proteína total).
1.1.3

 



plano del curso

biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
Escherichia coli (E. coli)
Jean-Pierre HERVEG* y Maritza BARCIA-MACAY.
*Université Catholique de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP) and ** Ludwig Institute of Brussels, Brussels, Belgium.