Cuestiones para el examen

1. ¿ Qué es un bacteriófago?
2. ¿ Dónde se encuentra el ADN del fago lambda ?
3. decribe la infección de la bacteria por el fago lambda.
4. ¿ Cómo el ADN del fago se vuelve circular?
5. Describa las secuencias cos.
6. ¿ Por qué ponemos de la maltosa y los iones magnesio para preparar los fagos lambda?
7. ¿ Qué es un concatenario?

8. ¿ Cuál es el papel de la ligasa en el cricularisation del ADN del phage lambda?
9 Describa la replicación de Cairns y la replicación en círculo rodante.
10. decribe la vía lítica y la vía lisogènica.
11. ¿ Cuál es el préstamo de la tecnología Gateway al phage lambda?
12. Explique la Encapsulación del ADN recombinado del fago.

plan

A. Introducción
.....1. definición
.....2. la infección
.....3. ADN linear y los extremos cos
.....4. el fago inyecta su ADN
.....5. El ADN se circularisa
.....6. fagos poco líticos

.....7. fagos lisogenos and gateway technologies (invitrogen)

B. Construcción de vectores lambda
.....1. Preparación del vector
.....2. Ligación de DNA extranjero
.....3. Encapsulación de ADN recombinado

C. Las placas en la práctica
D. Reseña histórica

A. Introducción

1. definición

Fago es la abreviación de bacteriófago, osea virus de bacteria. Como todos los virus, un fago se hace reproducir por la célula a la cual infecta. En el fago, el ADN se encuentra en la cabeza. El volúmen de la cabeza limita el volúmen de ADN y también la talla de inserto que el ADN del fago puede transportar. Una parte del ADN del fago no es necesaria para el biólogo molecular, y por lo tanto puede ser suprimida.
Aquí, un esquema del fago lambda --->

2. La Infección

La infección es realizada básicamente en dos etapas, la adsorción y la inyección del ADN.

La adsorción es reversible a bajas temperaturas, pero resulta irreversible una vez que el ADN ha sido inyectado. El fago lambda infecta eficientemente a la temperatura de 37°C. El proceso de infección requiere de energía metabólica del huésped.

El producto del gen lamb del fago, el cual está formando parte del extremo distal del tallo del mismo, reconoce al receptor de maltosa LamB ubicado en la membrana externa del huésped.

La inyección eficiente del ADN requiere además el producto del gen pstM, proteína relacionada en el transporte de fosfato y ubicada en la membrana interna. Se ha observado que la infección por éste ocurre sin cambios contráctiles en la estructura del tallo, a diferencia de lo que sucede con el fago T4.

Una vez que el ADN ha penetrado a la célula, es circularizado por unión de sus extremos cohesivos en los sitios cos (regiones de cadena sencilla de ADN de 12 nucleótidos y cuyas secuencias se complementan). Posteriormente los extremos del ADN son unidos en forma covalente por la ligasa del huésped.

3. ADN linear y los extremos cos

El ADN del fago lambda es una molécula linear de 48,5 kb. Contiene un ADN de aproximadamente 45.000 bp que terminan por dos extremos adhesivos y que están constituídos por 12 nucleótidos; que se denominan « secuencia cos», de apareo bien sólido, conteniendo en effecto 10 G ó C.

Los cos permiten a la molécula de ADN de circularizarse cuando éste es introducido en una bacteria.

El ADN del fago se sintetiza continuamente. Los genomes se forman y se unen los unos a los otros por los cos formando un polímero largo que se conoce como concatenario.

4. el fago injecta su ADN

Maltosa en el medio:
El fago lambda es adsorbido mediante receptores que para él existen, en la membrana externa de la bacteria E. coli. Esos receptores son codificados por el gen bacteriano lamB. Ellos sirven normalmente para introducir maltosa en la célula y son sólamente exprimidos en presencia de maltosa en el medio.

Para infectar las bacterias usADNo el fago lambda, lo primero que se hace es cultivarlos una noche en un medio rico en maltosa. La adsorcion de fagos por los receptores se mejora con iones de magnesio Mg++. La reacción se produce a los 20 minutos a 37°C.

5. El ADN se circulariza

En la bacteria, las extremidades cos del fago se aparejan para formar una molécula circular. Los enlaces diésteres se realizan por la ligasa y el ATP de la bacteria hospedadora del fago. En éste estado, el fago puede seguir sea la vía lítica ó la vía lisogénica.

6. Fago lítico

En la vía lítica, el ADN viral circular del fago es replicado de numerosas maneras.

replicación de Cairns ó en forma q
Durante la fase precóz de la infección, el ADN circular del fago l se replica en 2 direcciones a partir de un sólo punto de orígen. Esta manera de replicación se denomina en forma de Cairns ó en forma q .

círculo rodante « rolling-circle »:
Enseguida, ésta manera de replicación es remplazada por la replicación en círculo rodante « rolling-circle » que produce moléculas largas de ADN linear constituídas de genomas de fagos unidos uno a uno (concatémero).

Durante la fase tardía de la infección, se producen la expresión de proteinas que forman y asemblan las cabezas y las colas de los fagos, y también las proteinas que lisan bacterias.

La encapsulación:
Las secuencias cos del concatémero precedidas por el círculo enrollante son reconocidas por el producto del gen. La proteina A corta el ADN polímero del fago en monómeros é introduce cada monómero en una cabeza viral. Las partículas nuevas del fago son enseguida asembladas y la bacteria es finalmente lisada y rellenada de numerosas partículas virales.

7. fago lisogènico

El ADN del fago puede integrarse al genoma de la bacteria. El porqué de la elección del fago por la vía lítica ó la vía lisogénica es todavía estudiado y poco conocido al presente.

Recombinación con el cromosoma de la E. coli :
En la vía lisogénica, una recombinación se produce entre el ADN circulair del fago y el cromosoma de la E. coli gracias a una sequencia corta denominada "att" presente a la vez en ambos genomas: en el de la bacteria y en el del fago.

El gen cI codifica un represor del ciclo lítico:
El ADN del fago insertado en el cromosoma bacteriano se denomina un profago. La bacteria que contiene un profago se la conoce como lisógena. El genoma del fago es replicado y transmitido de una bacteria a la otra sin importar el gen del cromosoma bacteriano. A lo largo de la fase lisogena, el único gen de bacteriófago expresado es el gen cI que codifica un represor. Ese represor bloquea la transcripción precóz de gens del ciclo lítico y por consequencia también bloquea la expresión de los gens tardíos de ése ciclo.

El profago se integra bien justo hasta el momento en que una señal induce su expresión. Si se expone la bacteria a agentes que, como la luz ultravioleta, dañan el ADN, el represor cI sufre una separación proteolítica por la proteina bacteriana RecA. La inactivación del represor permite la transcripción de gens precoces.
Se observa luego de la inducción una reversión del proceso de crossing-over que conduce a la excisión de ADN del fago que entra entonces en la vía lítica.

ejercicio

gateway technology:


In phage lambda, the integration site is known as att P, in E. coli the site is att B. The att B site is short, only 25 bp. The att sites contain the binding sites for the proteins that mediate lambda recombination. The integration reaction (att B x att P) is mediated by the proteins integrase (Int) and host integration factor (IHF).

integration:
When integration occurs, two new sites are created, att L and att R, flanking the integrated prophage, with no loss of DNA sequence. All the att sites are alike in that they contain a 15-bp recognition sequence for the recombinase (integrase).

excision:
The reaction can also go in the opposite direction (excision). When att L x att R recombine (mediated by the proteins integrase, host integration factor and excisionase [Xis]), the lambda -DNA is excised from the E. coli genome, recreating the att B site in E. coli and the att P site in lambda.

Key points:
1. Site-specific recombination mediated by phage lambda recombination proteins.
2. The reaction is specific and directional:
att B x att P <=> att L x att R.
3. Each reaction is mediated by a different combination of enzymes.

The Gateway® reactions are in vitro versions of the integration and excision reactions. Your goal is to move your gene (or genes) from one vector backbone to another.

Let's first consider the LR Reaction for making expression clones.

1. Your sequence of interest (X) is cloned in an Entry vector that is transcriptionally silent, Kmr, and is flanked by two recombination sites (attL1 and attL2).
2. You want to move this sequence of interest to a Destination vector. It contains all the sequence information required for expression, and is Apr. This plasmid also contains two recombination sites (attR1 and attR2) that flank a gene for negative selection, ccdB.
3. You combine the two plasmid DNAs, each with sequences flanked by recombination sites that do not recombine with each other, but will recombine with sites resident on the other molecule.
4. LR Clonase™ is comprised of Int, IHF, and Xis; you are doing an in vitro version of the excision reaction.
5. Att1 and att2 sites confer directionality and specificity for recombination, so that only attL1 will react with attR1, and attL2 with attR2.
6. Two recombination events occur to make the expression clone, one between attL1 and attR1 and the other between attL2 and attR2.
7. The product of these two recombination events is the plasmid construct that you want and a by-product (labeled as the donor vector). The desired plasmid is under two forms of selection: antibiotic resistance and negative selection. Selecting for Apr eliminates the starting vector and the by-product; the presence of the negative selection marker eliminates the destination vector and co-integrate molecules.

B. Construcción de vectores lambda

 

No existe un gran número de fagos lambda comerciales. Aquellos que vos utilizarás son "prestados" con características propias que necesitarás estudiar.

El fago lambda contiene alrededor de 60 gens y de numerosos sitios de restricción en la parte esencial del genoma para el ciclo lítico.

Vector de reemplazo y:
La 1/3 parte del genoma viral es inútil para el crecimiento lítico. Se pueden conservar ó insertar fragment recombinantes, con una talla máxima de 10 kb. En contra, si por métodos moleculares se le saca las secuencias inútiles, es posible entonces insertar longitudes de fragmentos de hasta 22 bp.

1. Preparación del vector

En el caso de vectores de reemplazo, la digestión del ADN del vector mediante una enzima de restricción apropiada (Eco RI en el ejemplo de aquí) produce tres fragmentos : un fragmento corresponde (verde) a la parte central no esencial y dos fragmentos denominados brazos de fago (rojo).

2 brazios:
El brazo izquierdo (± 20 kb) y el brazo derecho del fago (8 à 10 kb) pueden ser separados del fragmento central (± 13 kb) por centrifugación a través de un gradiente de sucrosa. Como las extremidades cos del fago se aparean fácilmente en presencia de Mg++, se utiliza a menudo para purificar fragmentos de ± 30 kb correspondiente a los 2 brazos del fago asociados y eliminar un fragmento de ± 13 kb correspondiente al fragmento central. Jadis vende los dos brazos listos para ser utilizados.

Para el vector EMBL3A, se puede impedir el religado del fragmento central digeriendo el fago con dos enzimas de restricción diferentes pero con sitios muy cercanos a las horquillas de replicación que rodean el fragmento central (Sal I ADN Eco RI).

Si se elimina, por precipitación al isopropanol, tres cortos segmentos de ADN resultaran de la digestion del polilinker y los brazos de fago que tengan extremidades diferentes a aquellas del fragmento central no podrán unirse una con otra en presencia de la ligasa.

2. Ligado de DNA extranjero

Los brazos de fago se meten en presencia de fragmentos de ADN extranjero que posee extremidades compatibles con ellos (cortados con Sal I). La mezcla se somete a la acción de minúsculos volúmenes de T4 DNA ligasa y ATP (10 µl) de manera a facilitar los enlaces intermoleculares.

3. Encapsulación del ADN recombinado.

Los ADN recombinados se encapsulan in vitro para formar partículas de fagos viables que formen placas de lísis en un huésped apropiado (efficiencia : 108 placas/ µg ADN de fago l intacto). Alrededor de 0,05% a 0,5% de moléculas presentes en la reacción de ligado pueden ser encapsuladas como partículas virales infecciosas.
Existen varios sistemas. El más complejo utiliza dos extractos de encapsulación contenido en dos recipientes diferentes.

primer extracto:
En el primer extracto, el gen E se encuentra mutado, y en el segundo, el gen A es el mutado. Con el primer extracto se pueden preparar todas las partes del fago menos la cabeza.

segundo extracto:
El segundo extracto contiene cabezas vacías, porque la proteina mutada (A) es aquella que reemplaza las cabezas. Al ADN que se prepara se les añaden los dos extractos, los cuales fabrican instantáneamente los fagos recombinados con el ADN que se les ha subministrado.

D. reseña histórica:

 

En la historia : Bancos de ADN genómico en fagos (bibliotecas de DNA)
Antes de conocerse el secuencaje de genomas, se clonaban los genómas en el fago lambda. Se hidrolizaba todo un genoma con enzimas de restricción y los fragmentos así obtenidos se insertaban en DNA de fagos como se indica en la figura.