plan:
introducción
1. Los nucleótidos monofosfatados
2. Los enlaces diésteres.
3. Los puentes de hidrógeno.
4. la representación del ADN
5. La fusión del ADN y la PCR
6. Hibridación de ácidos nucleícos.

7. Marcaje de los ácidos nucleícos.
8. Agente intercalante (intercalating agent)
9. El ADN
10. Electroforésis en campo pulsátil (EGCP)
11. Concentración de ADN
12. La molécula de ADN de los organismos
13. el núcleo eucariótico en interfase

Cuestiones para el examen (2006)

1 . ¿ Qué es un nucleótido monofosfato?
2 . ¿ Qué son los enlaces ester, diéster?
3 . ¿ Cuántos puentes de hidrógeno hay entre A y T y entre G y C?
4a. ¿ Qué es un nick, un gap?
4b. ¿ Definir nick "traslación"?
5a. ¿ Cual es la diferencia entre la fusión y la desnaturalización del ADN?
5b. ¿ La fusión y la desnaturalización del ADN es reversible?
5c. ¿ Conoce una técnica que utilize la fusión (desnaturalización) ?
5d. ¿ Que significa la sigla Tm?
6a. Definir "hibridación".
6b. ¿ Podemos formar híbridos no naturales? ¿ Tienen un interés?
6c. ¿ Qué es una "sonda" ?
7 . ¿ Qué es la polinucleótido quinasa?

8a. definir "un agente intercalante"
8b. ¿ Cuál es el peligro de los agentes intercalantes?
8c. Cite a dos agentes intercalantes.
9a. ¿Los plásmidos son indispensables y cual son sus interés?
9b. ¿ Para qué sirven los telómeros?
9c. ¿ Cómo purificamos el ADN?
9d. ¿ El ADN es frágil?
10. ¿ Describa la electroforésis en campo pulsátil (o PFGE)?
12a. ¿ Cómo es el ADN empaquetado en el núcleo de los eucariotas?
12b. ¿ Por qué decimos que en los eucariotas hay una separación física entre la traducción y la transcripción?
12c. ¿ Dónde encontramos y para qué sirven las protaminas?

introducción.

La mayoría de las moléculas de ADN poseen dos cadenas antiparalelas (una 5´-->3´y la otra 3´--> 5´) unidas entre sí mediante las bases nitrogenadas, por medio de puentes de hidrógeno.
El ADN es una estructura en doble hélice.
Este fué postulada por Watson y Crick, basandose en:

La difracción de rayos X trabajo realizado por Rosalind Franklin.
La equivalencia de bases de Chargaff, que dice que la suma de adeninas más guaninas es igual a la suma de timinas más citosinas. Las bases nitrogenadas se hallan en relación molecular 1:1, la relación adenina + timina / guanina + citosina es de valor constante para cada especie animal.

La difracción de rayos X
Rosalind Franklin comenzó su trabajo sobre el ADN aislandolo y haciendo hilos muy finos de ADN. Preparó cadenas secas. Ella entonces los bombardeo con rayos de rayos X extrafinos. Sobre una placa fotográfica vacia una serie de manchas dispuestas de modo simétricos aparecieron.

Había obtenido fibras con mayor contenido de agua, ella dirigió a ellas sus rayos x. El resultado fue sorprendente:
el patrón de manchas generadas por la difracción de los rayos al pasar cerca de los átomos del ADN era mucho más sencillo que los que se habían obtenido hasta ese momento.

Rosalind Franklin obtuvo una fotografía de difracción de rayos X que reveló, de manera inconfundible, la estructura helicoidal de la molécula del ADN. Esa imagen, conocida hoy como la famosa fotografía 51, fue un respaldo experimental crucial para que el investigador estadounidense James Watson y el británico Francis Crick postularan su teoria de la doble hélice que les valió el Premio Nôbel.

Rosalind Franklin falleció en 1958, a los 37 años, víctima de un cáncer en los ovarios. Su invaluable aportación a este descubrimiento no ha sido nunca reconocido ni en vida de la cristalógrafa ni de manera póstuma...aunque poco a poco se empieza a conocer su historia.

Cuando Crick y Watson vieron las fotos de la estructura B,
inmediatamente supieron que tenían una segunda oportunidad
de resolver correctamente la estructura de la molécula.

Hasta ese momento, los datos no habían permitido comprobar plenamente que el ADN tuviera forma de hélice. Pero la fotografía de la estructura B mostraba claramente una serie de manchas en forma de cruz lo que para los expertos era señal inequívoca de una estructura helicoidal

1. Los nucleótidos monofosfatados

Los nucleótidos monofosfatados son ésteres de fosfato de pentosas en las cuales una base nitrogenada está unida al C1´ de una azúcar. En los ribonucleótidos (ARN) la pentosa es la D-ribosa, en los desoxiribonucleótidos (ADN, desoxiribonucleótidos), el azúcar es 2´-desoxi-D-ribosa (los números primos señalan posiciones de átomos del azúcar, los no primos corresponden a la base nitrogenada). El fosfato puede estar en posición 3´ó 5´. Si no hay fosfato en la molécula, el compuesto es un nucleósido.
Las bases nitrogenadas son moléculas planas, aromáticas y heterocíclicas, derivadas de la purina o de la pirimidina.

1. ¿ Qué es un nucleótido monofosfatado?

2. Los enlaces diésteres

Los nucleótidos monofosfatados de cada cadena son unidos entre sí por enlaces diésteres.

La ADNasa (DNasa) puede hidrolizar los enlaces fosfodiéster internos de cada cadena del ADN, formando los "nicks".
Las endonucleasas son enzimas que hidrolizan los enlaces fosfodiéster internos de un ácido nucleico y que lo fragmenta en oligonucleótidos.
Las exonucleasas son enzimas que hidrolizan los enlaces fosfodiéster finales de los ácidos nucleicos, es decir, los de las posiciones 5' y 3' y lo fragmenta en sus nucleótidos constituyentes.
Las endonucleasas de restricción son endonucleasas que se fijan sobre sitios palíndromos y corta el ADN en (tipo II) o fuera (tipo I) del sitio.

2. ¿ Qué son los enlaces ester, diester?

3. Los puentes de hidrógeno.

Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de ADN, se mantienen unidas entre sí porque forman enlaces (puentes de hidrógeno, hydrogen bounds) entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas.

La unión de las bases se realiza mediante puentes de hidrógeno, y éste alineamiento (annealed) está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). La estructura en doble hélice del ADN, con el alineamiento (annealing) limitado de bases ( A-T; G-C ), dicta que el orden ó secuencia de bases de una de las cadenas delimita automaticamente el orden de la otra, por ésto se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena, es posible deducir inmediatamente la secuencia de bases de la cadena complementaria.

3. ¿ Cuántos puentes de hidrógeno hay entre A y T y entre G y C?

4. la representación del ADN

Raramente se utilizara la representación del ADN en doble helice, pero se lo hará usando la representacion linear de nucleótidos con simples lineas. Una linea por secuencia.
La secuencia 5' ---> 3' se representarán con una linea:

5' ---------------------------------------------- 3'

Un "nick" es la ruptura de un enlace éster en un fosfato 5'., con la liberación de un grupo hidroxilo 3'. La ADNasa produce nicks.

Un "gap" de otra parte, es la desaparicion de una serie de nucleotidos contiguos.

Las exonucleasas 5' --> 3' pueden formar "gaps". Tanto los "nicks" como los "gaps" pueden ser reconocidos mediante el estudio de marcaje del ADN con la técnica de translación de nicks (nick translation) ó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real

4a. ¿ Qué nick, un gap?
4b. ¿ Que es nick "traslación"?

5. La fusión del ADN y la PCR

Las dos cadenas del ADN están unidas por puentes de hidrógeno. Las dos cadenas pueden separarse por acción del calor sin afectar los enlaces covalentes que unen a los nucleótidos. El proceso se conoce como fusión. Si las condiciones de temperatura vuelven a lo normal se restablece de nuevo la doble hélice.

fusión and Tm
Cuando la temperatura alcanza el punto de fusión del ADN, la agitación térmica es capaz de separar las dos hebras y producir una desnaturalización. Este es un proceso reversible, ya que al bajar la temperatura se puede producir una renaturalización. En éste proceso se rompen los puentes de hidrógeno que unen las cadenas y se produce la separación de las mismas, pero no se rompen los enlaces fosfodiéster covalentes que forman la secuencia de la cadena.

la temperatura de fusión: Tm
Las moléculas bicatenarias absorben menos que las monocatenarias en el ultravioleta. Por tanto, si se va observando la absorción a medida que se calienta un ADN bicatenario, el incremento en absorbancia cuando el ADN bicatenario se convierte en monocatenario nos indicará la temperatura de fusión (Tm; del inglés melting temperature). Tm, está en función del contenido en GC del ADN en cuestión, ya que los pares de bases GC se unen por 3 puentes de hidrógeno, mientras que AT sólo por dos. Cuanto mayor sea el contenido en GC mayor será la temperatura de fusión. Si el ADN calentado se enfría lentamente, la doble cadena vuelve a formarse (el ADN se renaturaliza). Esto permite realizar hibridaciones con cadenas de DNA procedentes de fuentes distintas.

La desnaturalización
Las cadenas del ADN también pueden separarse a temperatura ambiente cambiando las condiciones iónicas del medio. La desnaturalización del ADN puede ocurrir, también, por variaciones en el pH.

La PCR
En la reacción en cadena de la polimerase (PCR ó polymerase chain reaction) la molécula de ADN que va a copiarse se calienta (94°C) para que se desnaturalice y se separen las dos hebras (la PCR es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo).

6. Hibridación de los ácidos nucleicos

La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios usando la complementariedad de bases.

Cuando una solución de DNA que ha sido calentada se enfría lentamente se produce la rehibridación dando lugar a la estructura inicial. Tal reasociación ocurre sólo si las secuencias de bases son complementarias. Por lo tanto, la hibridación permite la formación de complejos bicatenarios no naturales de DNA:DNA y ADN:ARN.

Este es un método muy versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos nucleicos. También permite la detección de fragmentos de DNA que son complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas). Por ejemplo, se puede utilizar una sonda radioactiva para saber si en una mezcla desconocida existe algún fragmento complementario a la sonda. Para ello se usan membranas de nitrato de celulosa o de nilón.

Southern analysis:
La hibridación puede incluso realizarse después de la electroforésis. Los fragmentos de ADN se separan por electroforésis y después se transfieren a una membrana. Las moléculas de ácido nucleico se transfieren a las membranas bien por capilaridad ó aplicando corriente eléctrica y es entonces cuando se añade la sonda. La sonda, que es radioactiva, se unirá al fragmento(s) con el que tenga complementariedad y que se detectará por autorradiografía.

6a. Defina "hibridación".
6b. ¿ Podemos formar híbridos no naturales? ¿ Tiene algun interés?
6c. ¿ Qué es una "sonda" ?

7. Marcaje de los ácidos nucleicos.

La radioactividad se usa en la investigación de ácidos nucleicos porque puede ser detectada en cantidades muy pequeñas. Los ácidos nucleicos radioactivos pueden detectarse directamente en un contador de radioactividad o bien indirectamente sobre una placa fotográfica (autoradiografía).

Un ácido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente por la adición de fosfato radioactivo (fósforo 32) durante su síntesis. Así, si se añade fosfato radioactivo al medio de cultivo cuando está teniendo lugar la síntesis de DNA, el nuevo DNA será radioactivo.

32P3 -------> 32P-nucleótido -------> 32P-ácido nucleico

Alternativamente, se puede marcar radioactivamente el extremo 5' de una cadena de DNA usando ATP radioactivo marcado en el tercer fosfato.

El enzima polinucleótido quinasa quita específicamente el tercer fosfato del ATP y lo une al grupo hidroxilo 5' del ADN (El fosfato 5 ' es quitado por un fosfatasa).

32P -P-P-adenosina + HO-desoxiribosa-DNA -------> ADP + 32P -O-desoxiribosa-DNA

Esta técnica es extremadamente útil y rápida ya que permite el marcaje de moléculas de ADN ya pre-formadas.

Se han desarrollado nuevos métodos de marcaje de ácidos nucleicos que usan compuestos no radioactivos que se incorporan al DNA y pueden detectarse o bien porque dan un color determinado o incluso porque emiten luz (y por tanto pueden detectarse por autorradiografía). Algunos de estos métodos casi igualan al radioactivo en cuanto a sensibilidad teniendo la ventaja añadida de que no generan desechos radioactivos.

7. ¿ Qué es la polinucleótido quinasa?

8. Agentes intercalantes

Son compuestos que se insertan entre las bases de una molécula de ADN, interrumpiendo la alineación y el emparejamiento de bases de las cadenas complementarias (por ejemplo, colorantes de acridina, bromuro de etidio y SIBR green). Estos compuestos tambien se usan para colorear el ADN.

Bromuro de etidio:
Es un colorante que fluoresce cuando se encuentra unido al ADN de doble cadena. Induce citotoxicidad al intercalarse en el surco mayor de la hélice de ADN, con lo cual se altera la síntesis de ADN y su transcripción.

SIBR Green:
Colorante que fluoresce cuando se encuentra unido al ADN de doble cadena. Esta tinción fue introducida a mediados de la década de los noventa por la casa Molecular Probes, con el fin de ofrecer un producto menos tóxico que el bromuro de etidio, con mayor sensibilidad para la visualización de DNA y con un ámbito de fluorescencia que permitiera aplicaciones cuantitativas (PCR en tiempo real).

Utilizar una dilución final de 1:1000 de SIBR Green en la muestra de DNA. Se prepara un stock de 1:100 SIBR Green en DMSO, y se añade 1mL de dicha solución por cada 9 mL de muestra. El DMSO (en concentración final al 10%) no afecta apreciablemente al DNA.
8a. ¿ Definir un agente intercalante?
8b. ¿ Cuál es el peligro de los agentes intercalantes?
8c. Cite a dos agentes intercalantes.

 

9. El ADN

Las moléculas de ADN son frecuentamente largas y muy frágiles.

El ADN de los procariotas
El genóma bacteriano está constituido por una o dos moléculas de ADN circular de gran tamaño en donde residen todos los genes necesarios para una supervivencia autónoma. Por analogía con los eucariotas, esta molécula se denomina cromosoma, pero en su condición haploidía puede existir entre uno y tres en número de copias.
Desde 1964 se conoce la existencia de otros replicones en el genóma bacteriano, llamados plásmidos, la mayoría de los plásmidos son pequeños en relación al cromosoma (menores a 50 Kb). Dentro de los genes que suelen portar los plásmidos, se encuentran genes que confieren a la bacteria la capacidad de ocupar nichos ecológicos nuevos (como genes para resistencia a antibióticos, degradación de compuestos aromáticos o la capacidad de fijar nitrógeno) ó genes necesarios para la replicación y transferencia (por ejemplo conjugativa) del propio plásmido. Así, los plásmidos son considerados como componentes dispensables del genoma bacteriano.

En E. coli el ADN cromosomal es un polímero con un longitud de ± 4.000.000 bp. Cada espiral de ADN mide 3,2 nm y contiene 10 bp. El perímetro del ADN mide unos 1,28 mm.

El ADN de los eucariotas
El ADN nuclear de los eucariotas es linear. Cada cromosoma contiene solamente una sola molécula de ADN, donde cada extremidad esta protejida por un telómero. De manera que un ser humano tiene 46 moléculas de ADN.Los cromosomas humanos suman en total 4.000.000.000 bp, con lo que se puede calcular que una molecula de ADN mide aproximadamente 3 cm de longitud total.

Los pasos a seguir para realizar una extracción sencilla de ADN son: se parte de una suspensión celular, las células se lisan (SDS) para liberar el ADN, se añade alcohol y el DNA precipita en la interfase. Con la ayuda de una barrilla de vidrio se retira el DNA que se transfiere a otro tubo, ésta solución acuosa se trata con RNAasas para eliminar el RNA, las proteínas se eliminan usando fenol (las proteínas pasan a la fase orgánica y el DNA a la fase acuosa). Repitiendo éstos procedimientos varias veces puede conseguirse DNA puro. La solución de DNA así obtenida nunca tiene la misma longitud como de las moléculas nativas en la célula; la manipulación provoca roturas aleatorias del DNA. Si el DNA se ha manipulado con cuidado, la longitud de los fragmentos serán aproximadamente la centésima parte de la longitud total del cromosoma.

Las largas moléculas de ADN son bien asembladas dentro de los organismos. Pero asi mismo existen en éste, sistemas de reparación del mismo que permiten la reparación en permanencia de éstas moléculas. Todos los métodos de manipulación de ADN de una manera ó otra ocasionan su ruptura en fragmentos. Es de ésta manera que los investigadores utilizan métodos de purificación que permitan obtener los pedazos de ADN los más largos posibles., como por ejemplo la electroforésis en campo pulsátil.

10. Electroforésis en campo pulsátil (EGCP)

La electroforésis en campo pulsátil (o PFGE, por pulsed field gel electrophoresis en inglés) permite la separación completa de pequeñas secuencias de cromosomas y de largas secuencias de ADN. La longitud de las secuencias de ADN (100 ­ 1000 kb) está determinada para usar ADN concatémeros de fagos lambda.

10. ¿ Describa La electroforésis en campo pulsátil (o PFGE)?

11. Concentración de ADN

En el laboratorio, el ADN se conserva en solución dentro de microtubos crioscópicos a -80° C. Comummente el contenido de un tubo de microcentrifuga es de 1500 µL. Un área de superficie rugosa sobre la pared exterior del tubo permite de rotular su contenido. Los volúmenes de soluciones de ADN (obtenido con kits) son en general inferiores a 100 µL, con concentraciónes entre 0,1 y 1 µg por µL.

Es necesario conocer la concentración y la calidad del DNA que se manipula. Para determinar su concentración, la longitud de onda utilizada es de 260 nm y una extinción de 1,000 corresponde a una concentración de 50 µg de ADN por mL.

La mayoria de manipulaciones de DNA exigen un rango de pureza, con lecturas de extincion a 280 nm entre 1,8 y 2 veces superiores a aquellas leídas a 260 nm. Si los valores son mayores o menores a éste rango, será entonces necesario re-purificar la muestra de ADN antes de utilizarlo.

Por ejemplo, en la práctica:

encender la lámpara UV del espectrofotómetro, 1 hora antes de la lectura.
Escrupulosamente limpiar 2 cubetas de cuarzo.
Un espectrofotómetro ZEISS permite leer la absorbancia de un volúmen de 600 µM.

Con ADN preparado con un kit del comercio, generalmente hay que diluir 10 veces (60 µL de solucion + 540 µL de solvente) antes de hacer la lectura. El blanco de la muestra es el solvente utilizado.

12. El ADN de los organismos

Los procariotas:

El ADN es el materiál genético común de todos los seres vivos. Los procariotas (bacteria y archaea) no poseen núcleo, no existe separación física entre la traducción y la transcripción.

Los procariotas poseen uno ó dos cromosomas circulares. E. coli por ejemplo posee un cromosoma circular de aproximadamente 4 millones de pares de nucleótidos. Esta es una molécula gigante de una circunferencia de 1,9 cm. En los procariotas también, pequeñas moléculas de ADN circular pueden ocasionalmente encontrarse y se las conoce como plásmidos.

Los eucariotas:

Los eucariotas en cambio poseen un núcleo. El lugar donde la traducción y la transcripción se realiza son independientes. Estos sitios están separados por la pared nuclear. Los transcriptos son enviados del núcleo al citosol a través del poro nuclear.

En los eucariotas el empaquetamiento es más complejo y compacto y para ésto necesita la presencia de proteinas, como son las histonas y otras de naturaleza no histona (en los espermatozoides las proteinas son las protaminas). A esta unión de ADN y proteinas se conoce como cromatina, en la cual se distinguen diferentes niveles de organización.

El ADN humano contiene a 6 mil millones de pares de bases de nucleótidos. Esto hace por lo menos dos metros de cadenas de ADN. Aquellas cadenas tienen que ser almacenadas dentro de ± 6 µ el núcleo clasificado de m de cada célula.: Claramente demasiado grande para caber en el núcleo. Hace falta pues un mecanismo que permita almacenar todo. Este mecanismo debería permitir a ciertas proteínas para tener acceso a las partes específicas del ADN y el puesto en otras partes. Los eucariotas utilizan los nucleosomas. Un nucleosoma está constituido de:

± 200 pb de DNA
2 moléculas de histona H2a
2 moléculas de histona H2b
2 moléculas de histona H3
2 moléculas de histona H4
1 molécula de histona H1

La continuación del empaquetamiento es descrita en la figura de derecha.

El empaquetamiento del DNA eucariótico en nucleosomas, y estos a su vez en estructuras de mayor complejidad, representa un obstáculo para la transcripción así como para otros procesos del metabolismo del DNA como la replicación, la reparación y la recombinación. La activación, la represión y el silenciamiento transcripcional conllevan cambios en la estructura de la cromatina de promotores y regiones reguladoras. Estas remodelaciones cromatínicas son llevadas a cabo por dos grandes familias de modificadores de la cromatina:
i) enzimas que modifican covalentemente las histonas (acetiltranferasas y deacetilasas de histonas, metilasas, quinasas y fosfatasas de histonas) y
ii) Maquinarias de remodelación de la cromatina con gastos de ATP.

13. el núcleo de la célula eucariótica en interfase

El nucleo de la célula eucariótica dirige las actividades de la célula y en él tienen lugar procesos tan importantes como la autoduplicación del ADN o replicación, antes de comenzar la división celular, y la transcripción o producción de los distintos tipos de ARN

El núcleo cambia de aspecto durante el ciclo celular y llega a desaparecer como tal. Por ello se describe el núcleo en interfase durante el cual se puede apreciar las siguientes partes en su estructura:

1. envoltura nuclear: formada por dos membranas concéntricas perforadas por poros nucleares. A través de éstos se produce el transporte de moléculas entre el núcleo y el citoplasma.

2. el nucleoplasma, que es el medio interno del núcleo donde se encuentran el resto de los componentes nucleares.

3. nucléolo, o nucléolos que son masas densas y esféricas, formados por dos zonas: una fibrilar y otra granular. La fibrilar es interna y contiene ADN, la granular rodea a la anterior y contiene ARN y proteínas.

4. la cromatina, constituida por ADN y proteinas, aparece durante la interfase; pero cuando la célula entra en división la cromatina se organiza en estructuras individuales que son los cromosomas.