biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
expressión de genes clonados en levaduras
Jean-Pierre HERVEG* y Maritza BARCIA-MACAY**
*Université de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.

plan
Cuestiones para el examen


1. ¿ Por qué utilizar la levadura para producir proteínas?
2. Cite modificaciones post-transduccionales.
3. Que es una levadura auxótrofa.
4. Dar un ejemplo de levadura auxotrophe.
5. Que es una levadura protótrofa.
6. Describa un vector utilizado en las levaduras.
7 ¿ Cómo inducimos los plásmidos en levadura?
8. ¿ Cuáles son las características del plásmido 2 mu?
9. ¿ Cómo se precipitan las proteínas codificadas por los plásmidos pESC?
10. Describa el sistema del doble híbrido.
11. ¿ Cómo se produce la vacuna contra la hepatitis B?


porqué las levaduras
cuales levaduras (autótrofas y protótrofas)
los plásmidos adaptados

orígen de replicación
YEPs Yeast episomal plásmidos
YCPs Yeast centromer plásmidos
promotores inducibles y genes de selección.
UAS Upstream activating sequence
los genes GAL


estructura de GAL4
sistema doble híbrido
sistema triple híbrido
Expresión en Pichia pastoris
vacuna contra la hepatitis B

algunos vectores:

pESC de Stratagene
pYC vectores de Invitrogen


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Porqué las levaduras:

producción de proteínas modificadas:

Cuando las células bacterianas son incapaces de modificar correctamente una proteína recombinada, se procede a la producción de la misma en organismos eucariotas. Las levaduras constituyen a menudo el primer recurso en el que se pueden expresar genes eucariotas que son incorrectamente expresados en bacterias.

Las levaduras se multiplican rápidamente :
ellas se dividen cada dos horas.

Su genoma:
Las levaduras están bien caracterizadas desde el punto de vista genético. Su genoma mide 1,4 10
7 nucleótidos (osea de 3 a 4 veces más que el de la E. coli). Ha sido enteramente secuenciada.

Las levaduras producen pocas proteínas y aquellas que en ella se secretan mantienen las modificaciones post-transduccionales que tiene lugar pendiente la secreción.

Las levaduras se utilizan como vectores de expresión para exprimir proteínas de mamíferos glicosiladas. El uso de levaduras también permite entre otros de analizar la función de esas proteínas en un medio eucariota y de utilizar las señales de secuencias intracelulares que permiten de enviar esas proteínas a un organito.

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Cuales levaduras ?


Levaduras auxótrofas
un auxótrofo es un organismo que requiere uno o más factores orgánicos (como amino-ácidos, nucleótidos, o vitaminas) que no le son necesarias al tipo salvaje.

La mayoría de las cepas de levadura que se utilizan en la actualidad son auxótrofas , c.-à-d. deficientes en una ó más enzimas implicadas en la biosintesis de un aminoacido o de un nucleótido (Fig. 79). Las levaduras auxótrofas no se reproducen en medios que permiten el crecimiento de la especie salvaje; ellas necesitan un medio que contenga el producto final de la vía metabólica defectuosa.

Por ejemplo, una levadura auxótrofa por la histidina necesita la presencia de histidina en el medio.

Los plásmidos que contienen el gen HIS3 que codifica la enzima deshidratasa imidazole glicerol fosfato pueden ser introducidos en levaduras auxótrofas a la histidina mediante un procedimiento análogo a la transformación bacteriana. El gen HIS3 codifica la enzima necesaria a la levadura auxótrofa y le permite de reproducirse en un medio desprovisto de histidina.

levadura protótrofa :
Las levaduras se convierten en protótrofas cuando el marcador metabólico es expresado. El gen HIS3 puede entonces utilizarse para seleccionar las levaduras transformadas del mismo modo que el gen de resistencia a la ampicilina presente en un plásmido bacteriano permite seleccionar bacterias transformadas.

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los plásmidos adaptados:

Una segunda etapa en la aplicación de têcnicas de ADN recombinante en levaduras ha sido en la construcción de plásmidos con buena capacidad de replicacion en levaduras, y no sólo como tradicionalmente en la E. coli.

Tales vectores permiten la amplificación de plásmidos recombinados en bacterias antes de ser introducidos en las levaduras. Esos vectores son especiales pues contienen orígenes de replicación que funcionan en ambos organismos, y así mismo un gen de resistencia a un antibiótico y un marcador de selección metabólica.


YEP, yeast episomal plasmids


Ciertos vectores (YEP o Yeast episomal plasmids) contienen el orígen de replicación de un plásmido natural de S. cerevisiae, el plasmido 2 µ (mu, letra griega). Tal vector se mantiene en forma de epísomos en nûmero de 10 a 40 copias por cêlula. Los plásmidos que contienen las secuencias 2 µ sont relativemente estables en la levadura, c.-à-d. son transmitidos eficientemente a la descendencia durante la mitosis.

Los vectores pESC constituyen una serie de vectores epítopes marcados diseñados para la expresión y el análisis funcional de genes eucariotas en la levadura S. cerevisiae. Estos vectors contiene los promotores GAL1 y GAL10 de levadura.

Los ADN codifican los peptidos DYKDDDK y EQLISEEDL, junto a los cuales se inserta el cDNA que codifica la proteina en estudio. Es asi que luego la proteina puede ser luego reconocida y purificada (precipitacion, anticuerpos para estas secuencias, columna de afinidad), sin necesidad de utilizar un anticuerpo dirigido al gen mismo.

 
YCP ou Yeast centromere plasmids:


Otros vectores (YCP o Yeast centromere plasmids) contienen un orígen de replicación cromosómico ARSH4 (Autonomous replicating sequence, secuencia de replicación autónoma) y un centrómero CEN6 : ellos estan presente en nûmero de 1 a 2 copias por cêlula .

Los vectores pYC

contienen el orígen de replicación para un nûmero pequeño de copias CEN6/ARSH4 en levadura. Se encuentran disponibles con una variedad de marcadores de selección. A los vectores pYC tambiên se los encuentra con una variedad de epítope tags (marcadores epitopes) para la detección y purificación de proteínas recombinadas. El vector pYC2/NT contiene un N-terminal Xpress™-6xHis tag, mientras que los vectores pYC2/CT y pYC6/CT (Figura 6) contienen un C-terminal V5-His tag. Tanto el vector pYC2/NT como el pYC2/CT poseen el gen marcador URA3 para su selección. El vector pYC6/CT contiene el gen de resistencia al Blasticidin para su selección en levadura.


promotor inducible y gen de selección:
El gen de interês se clona a menudo adelante del promotor inducible, GAL1 o GAL 10, ó los dos. El promotor es reprimido en presencia de glucosa e inducido en presencia de la galactosa.

UAS (Upstream Activating Sequence):
Los genes GAL producen enzimas responsables del metabolismo de la galactosa. Los promotores des genes GAL1 y GAL10 se activan cuando el factor de transcripción GAL4 se fija en la secuencia UAS (Upstream Activating Sequence), que es la equivalente del enhancer en la levadura. La proteína GAL80 no permite êsta activacion cuando se une a GAL4.

la galactosa se une a GAL80 que libera GAL4:
Los genes GAL son inducidos por la galactosa, puesto que estos al unirse con GALBO liberan el factor de transcrpción GAL4.

El inserto debe terminarse mediante un terminador de levadura.


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Estructura de GAL4

La proteina GAL4 está constituida por :

N-terminal que se une específicamente a una secuencia de ADN (UASG por upstream activated sequence for the yeast Gal genes).
C-terminal que contiene una región ácida. Las cargas negativas intervienen en la activación transcripcional.

Cuando el factor de transcripción GAL4 se une, activa la transcripción del gen reportero (reporter). A mayor la carga negativa, mejor es la actividad transcripcional.


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La técnica del doble híbrido.

El objetivo de la técnica es el de encontrar las proteínas Y capaces de unirse a la proteína X.

El modelo.


El sistema del doble híbrido permite de identificar una interacción proteína-proteína (X-Y) en vivo mediante la reconstitución de un activador de la actividad transcripcional (N-C).

El método, se basa en las propiedades de la proteína GAL4 de la levadura S. cerevisiae, y consiste en la separación del dominio responsable de la unión al ADN (N) y de la actividad transcripcional (C). N y C funcionan de manera independiente y pueden por lo tanto ser separados.

Dos tipos de plásmidos codificantes se construyen. Ellos codifican cada uno proteínas híbridas.
El primer tipo sólo contiene un plásmido. Este contiene un gen que codifica el dominio de GAL4 uniêndose al ADN (N) fusionado al gen de la proteina X.
El segundo tipo contiene un gran número de plásmidos, que contienen el dominio del activador de GAL4, activador de la transcripción (C), fusionado a uno de los genes que codifican las proteinas Y. Se producen asi tantos plásmidos del segundo tipo como de ARNm en las cêlulas investigadas.

Un plásmido de cada tipo se introduce al interior de la levadura.

La interacción entre las dos proteínas X y Y conducen a la reconstitución de una proteína GAL4 funcional y por tanto a la activación de la transcripción del gene reportero que contiene un sitio de unión a GAL4.

La proteína asociada al dominio de unión al ADN se denomina "cebo". Un cebo es generalmente una proteína que se la usa para encontrar compañeros celulares.

La proteína asociada al dominio activador de la transcripción se la denomina "presa". La proteina presa es a menudo la desconocida. Los elementos de un banco provisto de un tipo celular conocido, se los enlaza al dominio terminal del gen GAL4 para la identificación de las proies.


Aplicaciones del modelo doble híbrido.

Este permite :
·de poner en evidencia las interacciones proteína-proteína;
·de identificar las mutacions que podrían afectar las uniones;
·de identificar los dominios de la proteína implicados en la unión;
·de identificar nuevas parejas.


El método del triple híbrido


En el mêtodo del triple híbrido, la interacción entre el appát y la proie se controla y depende de la expresión de una tercera proteina, denominada proteina de union (Z).


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Expresion en Pichia pastoris

Otra especie de levadura, Pichia Pastoris, es capáz de producir cantidades importantes de proteina recombinada, a veces del orden de gramo por litro. Pichia Pastoris es una levadura metilotrofa. En ausencia de glucosa como fuente de carbono, êsta levadura es capáz de utilizar el metanol. El promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) controla la expresión de alcohol oxidasa, que cataliza la primera etapa de la via metabólica del metanol. Como la enzima posee una actividad específica dêbil, ella es producida en la levadura en grandes cantidades. Cuando las cêlulas son incubadas en presencia de grandes cantidades de metanol, la alcohol oxidasa constituye más del 30% de proteínas solubles. En ausencia de metanol, no se detecta la presencia de la alcohol oxidasa.

Se han construido vectores que permiten clonar genes de interês a lo largo del promotor AOX1 (Fig. 83). Este promotor, inactivo en presencia de glucosa, es metanol inducible. Ciertos vectores tambiên contienen una secuencia señal, a menudo aquella de una feromona ó de un factor que le permite el acoplamiento a levaduras (Fig. 83). Las proteínas que contienen esas señales son las que se secretan en el medio.



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vacuna contra la hepatitis B:

HBsAg y la proteína core de HBV
Algunas têcnicas de ingenería genêtica han probado ser excelentes en la fabricación de vacunas para viruses que no han sido posible de amplificar usando cultivos celulares. Un ejemplo es el virus de la hepatitis B (HBV). En el tiempo, el ûnico medio disponible de estudiar êste virus era mediante el aislamiento de partículas virales de la sangre de individuos afligidos. En 1979, el genoma del virus de la hepatitis B (3,2 kb) fue clonado y secuenciado totalmente. Esto permitió de conocer la secuencia en terminos de aminoácidos de dos proteínas virales: la proteína core (central) asociada al ADN del virus y la proteína antigênica mayor (HBsAg) que forma parte de la envoltura del virus.


la proteína central y la bûsqueda de anticuerpos:

En la sangre de pacientes infectados, se encuentran no sólo el virus entero sino tambiên agregaciones significantes de la proteína HBsAg. La proteína central (core) se fabrica en la actualidad en la E. coli y es la utilizada en la investigación de anticuerpos en la sangre de personas infectadas.

el clonaje de HBsAG como vacuna:
El clonaje del gen codificador del ántigeno mayor, HBsAg no pudo hacerse directamente en la E. coli. Este gen fue entonces ligado a un promotor de levadura, el promotor de la alcohol deshidrogenasa fue clonado en un vector de copias elevadas en la levadura. El gen HBsAg fue modificado para que la proteína no se secrete. Las levaduras transformadas por el plásmido producen grandes cantidades de la proteína viral, alrededor de 1 al 2 % de las proteínas totales de la levadura. Al cultivar las levaduras en grandes fermentadores, se producen entre 50 a 100 mg de proteínas por litro de cultivo. Estas proteínas son fuertemente parecidas a la proteína viral natural; formando agregados de alrededor de 20 nanómetros de diámetro muy parecidos a los agregados immunógenos encontrados en los pacientes afectados. La proteína producida en la levadura es actualmente comercializada y permite de vacunar contra la infección producida por el HBV.




pESC de stratagene:

Los vectores pESC comprenden una serie de epitope-tagging vectores designados para la expresión y el análisis funcional de genes eucariotas en la levadura S. cerevisiae. Dichos vectores contienen los promotores de levadura GAL1 y GAL10 en orientaciones opuestas. Mediante estos vectores uno o dos genes clonados pueden introducirse en una variedad de levaduras huêspedes bajo el control de un promotor represible. Cuando dos genes son co-expresados, interacciones proteína-proteína pueden ser confirmadas mediante análisis de immunoprecipitación. Esos vectores contienen una secuencia polilinker extensible y transcriptos finales especificos de RNA generados de promotores T3 y T7. Cada uno de los vectores pESC contienen uno a cuatro marcadores selectivos de levaduras (HIS3, TRP1, LEU2, o URA3) en el mismo esqueleto, lo que permite la expresión y el análisis de epitope-tagging de dos genes diferentes en una sola cêlula de levadura.



Los vectores pPICZ A, B, y C de aproximadamente 3.3 kb, son usados en la Pichia pastoris para la expresión de proteínas recombinantes. Proteínas recombinadas se expresan fusionadas a pêptidos en C-terminal que contienen el epitope c-myc y una cola marcada polihistidina (6xHis). Estos vectores permiten un gran nivel de expresión, metanol inducible, con la expresión del gen de interês en Pichia, que puede ser utilizado en cualquier especie de Pichia , incluyendo X-33, GS115, SMD1168H, y KM71H. pPICZ contiene los siguientes elementos :

- fragmento 5°¨que contiene el promotor AOX1 para una expresión bien regulada, metanol inducible por el gen de interês.
- un gen de resistencia a Zeocinó para la selección, ya sea en E. coli ó Pichia
- el brazo c-terminal de un pêptido que contiene un c-myc epítope y una cola polihistidina (6xHis) tag para la detección y purificación de una proteína de fusión recombinada (si deseado)
- Tres marcos de lectura (reading frames) para facilitar el clonaje en marco (in-frame cloning) con la extremidad C-terminal del pêptido.

El inserto debe contener un codón de inicio ATG, como parte de secuencia consensus en levadura. Un ejemplo de una secuencia consensus en levadura se presenta a continuación.

(G/A)NNATGG


plano del curso

biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
expressión de genes clonados en levaduras
Jean-Pierre HERVEG* y Maritza BARCIA-MACAY**
*Université de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.

Universidad catholica de Louvain, Facultad de Medicina