Universidad catholica de Louvain, Facultad de Medicina 

biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
microarrays
Jean-Pierre HERVEG*, Maritza BARCIA-MACAY et Bernard LETHE*
*Université Catholique de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.

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plan:

1. Cuestiones para el examen.
2. ¿Cuáles son los ADN Microarrays?
3. Vaya a tomar las Affymetrix chips como un ejemplo.
4. Preparación de nuestras sondas.
5. mismatch sondas
plan:

1. Cuestiones para el examen.
2. What are DNA Microarrays?
3. Let's take the Affymetrix chips as an example.
4. Preparation of our probes.
5. mismatch probe:

1. Cuestiones para el examen:
1. Questions for the examination:

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2. ¿Cuáles son los ADN Microarrays?

Los ADN Microarrays son apoyos sólidos en los cuales las secuencias de genes diferentes son atandas. Los apoyos son a menudo placas de microscopio. Ellas también podrían ser chips de silicio o membranas de nilón. El ADN es imprimido, manchado, o aún sintetizado directamente en el apoyo (PCR).

En inglés, "to array " quiere decir "colocar en un arreglo ordenado ". En un microarray los secuencias génicas son atadas al apoyo de un modo ordenado: se usa la posición de un mancha (spot) para identificar una secuencia génica. Las manchas (spots) son ADN, cDNA, u oligonucleótidos.

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apoyo: support
placas de microscopio: microscopic slides
Manchado (manchar): spotted (to spot)

2. What are DNA Microarrays?

DNA Microarrays are solid supports onto which the sequences from different genes are attached. The supports themselves are often microscope slides. They could also be silicon chips or nylon membranes. The DNA is printed, spotted, or even synthesized directly onto the support (PCR).

To array means "to place in an orderly arrangement".The gene sequences in a microarray are attached to the support in an orderly way, because we use the location of a spot to identify a gene sequence. The spots are either DNA, cDNA, or oligonucleotides.



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support: apoyo, ayuda, respaldo
microscopic slides: placas de microscopio.
spot: un lugar en que secuencias de un gen son atandas


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3. Vaya a tomar las Affymetrix chips como un ejemplo:

preparación de una plaquilla
(Affymetrix GeneChips)

Máscara

Una oblea de cuarzo esta cubierta con un compuesto sensible a la luz (mask). Este compuesto previene aparearse entre la oblea y un nucleótido no deseado. La máscara esta usada para Bloquear el acceso a la luz en lugares específicos. La superficie entonces es cubierta con una solución que contiene o adenine, o thymine, o cytosine, o guanine. Enganche del nucleótido ocurre sólo en aquellas regiones que han sido deprotegerado por la iluminación.

Por ejemplo:
La luz es usada para deproteger algunos sitios donde As (adeninas) deben ser añadido. La oblea entonces es inundada con una solución de As. Un A atado sólo donde la oblea esta
deprotegerido. Pero El A que fue añadido tienen también una protección que previene otros nucleótidos atar. La luz de láser deprotect ahora lugares donde una G debería ser atada. Una solución que contiene la G es añadida....El proceso es parado cuando los oligos tienen ± 25 nt.

3. Let's take the Affymetrix chips as an example:

preparation of a GeneChips
(Affymetrix)

Masks

To start the process, a quartz wafer is coated with a light-sensitive compound (mask). This mask prevents coupling between the wafer and an unwanted nucleotide. This mask blocks the access of light onto specific locations of the wafer surface. The surface is then covered with a solution containing either adenine, or thymine, or cytosine, or guanine. Coupling of the nucleotid to the glass occurs in those regions that have been deprotected through illumination.

for example:
The light is used to deprotect sites where As are to be added. The wafer is then flooded with a solution contianig As. The As attached only where the wafer is deprotected. But the As that were added have also a protection which prevent other nucleotides to attach. The laser light deprotect now places where a Gs should be attached. A solution containing Gs is added....
The process is stopped when the attached oligos are ± 25 nt long.


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4. Preparación de nuestras sondas:

Preparación de los ARNms de la muestra que queremos probar.Síntesis de la cadena simple de cADN (ss cDNA) conteniendo la secuencia del promotor T7: utilización de un cebador hecho de poli-dT conectado a la secuencia de promotor T7 (rectángulo azul)
Estos cADNs sirven como plantillas en el " en vitro " síntesis de las cARNs. Estos cARN serán sintetizadas con la U-biotina. Biotin debería atar la streptavidin.
Ellos cARN serían usados como sondas para comprobar las "arrays".


4. Preparation of our probes:

Preparation of ARNm of the sample we want to test.Synthesis of single-stranded cADNs (ss cADN), using a cebador made of poli-dT connected to the T7 promoter sequence (blue rectangle)Synthesis of double-stranded cADN containing the T7 promoter sequence.This cADN serves as a template in the "in vitro" transcription of complementary ARN (cARN) These cARN are biotin labeled. They would be used as probes to check the arrays.
___________________________
mRNA: ARN mensajero (messenger RNA o mRNA).
ss cDNA: cadena simple (ss), copia (c).
cebador: primer.
biotin:
es diseñado para seguir la localización de los cARNs. la localización del cARN utiliza la tecnología estreptovidina/avidina (avidina fluorescente)


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Component name Concentration Volume

T7-Oligo(dT) Primer, .....50 µM..............120 µL
5X 1st Strand Reaction Mix.
..................120 µL
DTT, 0.1M
.....................0.1M............... 60 µL
dNTP, 10 mM 10 mM 120 µL 1
SuperScript™ II 200 U/µL 60 µL 1
5X 2nd Strand Reaction Mix 5X 900 µL
E.coli DNA Ligase 10 U/µL 30 µL 1
E.coli DNA Polymerase I 10 U/µL 120 µL
RNase H 2 U/µL 30 µL 1
T4 DNA Polymerase 5 U/µL 60 µL
EDTA, 0.5M 0.5M 300 µL
RNase-free Water 3.1 mL


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5. Sonda emparejando mal

Cada sonda es diseñada para encontrar si una secuencia complementaria ( ARN o ADN) está presente o no presnte en la muestra. Varias sondas son hechas para la medida de cada ARN o gDNA. La longitud de la sonda (25-mer) confiere una alta especificidad. Para aumentar la sensibilidad y la reproductibilidad, múltiples sondas son usadas. 22 sondas rutinariamente son usadas para cada medida de ARN y 40 para cada gDNA.

Para cada sonda que empareja una secuencia, hay una sonda de desajuste. Una sonda de desajuste contiene un desajuste solo localizado directamente en medio de la secuencia de sonda de 25 bases. La sonda perfecta proporciona la fluorescencia mensurable cuando la muestra le ata. otra sonda es usada para descubrir cualquier fluorescencia de contaminación dentro de aquella medida.
5. Mismatch probe:

Each probe is designed to find whether or not a complementary sequence of (RNA or DNA) is present in the sample. Several probes are made for the measurement of each RNA or gDNA. The length of the probe (25-mer) confers a high specificity. To increase the sensitivity and reproducibility, multiple probes are used. 22 probes are routinely used for each RNA measurement and 40 for each gDNA.

For each probe that matches its target sequence, there is a mismatch probe. A mismatch probe contains a single mismatch located directly in the middle of the 25-base probe sequence. The perfect probe provides measurable fluorescence when sample binds to it. the other probe is used to detect any contaminating fluorescence within that measurement.

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biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
Reacción en cadena de la polimerasa (la PCR)
los cebadores
Polymerase chain reaction (PCR) primers
Jean-Pierre HERVEG*, Maritza BARCIA-MACAY et Bernard LETHE*
*Université Catholique de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.