Cuestiones para el examen


1. ¿ Qué es un plásmido, un episomo ?
2. ¿ Son los plásmidos dependientes del cromosoma bacteriano para sus reproducción?
3. definir "Transformar una bacteria ó una levadura"
4. ¿ Que quiere decir la palabra "transformar" para las células eucarióticas, salvo las levaduras?.

5. ¿ Cuáles son los métodos utilizados para transformar las bacterias?
6. ¿ Quese llama origen de replicación?
7. ¿ Que es un plásmido recombinado?
8. ¿ Que es que marcador de selección?
9. ¿ Cuál es el interés de colocar un gen en LacZ?
10. Definir " polilinker".
11. Definir la clonación direccional.
12. ¿ A qué sirve la defosforilación?

plan

A. Introducción
..........1. los plásmidos y episoma (plásmidos F).
..........2. conjugación, sexducción y el plásmido R.
..........3. tipos de plásmidos
..........4. estructura de los plásmidos
..........5. transformación
..........6. Los marcadores de selección
..........7. el replicón y el orígen de replicación
..........8. clonación y los sitios de clonaje
..........9. cualidades de un vector de clonaje

B. Algunas técnicas de clonaje
..........1. inserción de un gen de resistencia

..........2. inserción de un LacZa
..........3. clonaje direccional
..........4. desfosforilación

C. El opéron lactosa
..........1. la ß-galactosidasa:
..........2. el péptido alfa LacZ (lacZa)
..........3. los inductores: lactosa y IPTG:
..........4. el operador
..........5. La fijación del represor-lac en el operador
..........6. la lactosa estorba al represor de reaccionar
..........7. los otros gens del operón lactosa:

A. Introducción

1. Los plásmidos de bacterias

Son moléculas de ADN circular o lineal de 1 kb a 250 kb, contienen de 2 hasta 30 genes. Los plásmidos se réplican y se transmiten independientemente del cromosoma bacteriano. La replicación y la transcripción de los plásmidos dependen de las proteínas de la célula huésped. Los gens codificados por los plásmidos le donan ciertos privilegios a la célula huésped.

El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética por la facilidad con la que se manipulan. Los plásmidos usados en Ingeniería Genética contienen uno o dos genes que les confieren resistencia a antibióticos (marcadores selección) y permiten seleccionar clones recombinantes

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Episoma: Si el plásmido posee la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano se le denomina episoma. Dentro de este grupo de plásmidos se encuentran los factores de fertilidad o plásmidos F, que regulan el proceso de conjugación bacteriana..

 

2. Conjugación, sexducción y plásmido R


La conjugación bacteriana es un proceso por el que se transfiere material genético (un plásmido o el genoma bacteriano) entre bacterias. La célula que aporta el material genético se llama donadora y aquélla que lo recibe receptora.

La bacteria donadora debe tener un plásmido, el factor F, que contenga la información genética necesaria para la formación del pili sexual. Un pilus es un "tubo" que se extienden desde la superficie de la célula bacteriana donadora.

Se llama (F-) a las bacterias que no poseen el plásmido F, (F+) si poseen dicho factor en su citoplasma y (Hfr) (High frequency of recombination) si el plásmido F está integrado en su cromosoma (episoma), lo que aumenta la frecuencia de la transferencia

La restricción limita en todos los casos la conjugación (ver el capítulo sobre las enzimas de restricción).

Una bacteria receptora recibe ADN de la célula donante. Una vez que el fragmento de ADN de la donante está dentro de la célula receptora es posible la recombinación: el ADN de la donante se alinea con el de la receptora y por entrecruzamiento (crossing over) se intercambian genes, pasando a formar parte del genoma.

Una variante de la conjugación es la sexducción. En la sexducción un trozo definido de material genético de la donadora es transferido como parte de un plásmido conjugativo.

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El plásmido F contiene 25 genes que controlan la producción de los pilis.
Los pili se observan prácticamente solo en bacterias Gram negativas y solo escasos organismos Gram-positivos los poseen.
El plásmido R confiere, a las células que lo poseen, resistencia a los antibióticos o drogas. Un plásmido R puede llegar a tener hasta 10 genes que confieren resistencia y pueden transferirse a otra
bacteria por la conjugación. El plásmido R pueden también ser transmitidos por virus, por ejemplo el fago P1: un error de encapsidation del fago P1 permite la integración del plásmido en el capside.

3. Tipos de plásmidos:

Podemos clasificar los plásmidos basándose en su función.

a. "Fertility - (F) plasmids" son capaz de conjugación.
b. " Resistance - (R) plasmids " contienen los gens que pueden construir una resistencia contra antibióticos o venenos.
c. "Col-plasmids" contiene gens que codifican colicinas, proteínas que pueden matar otra bacteria.
d. " Degrative plasmids " permiten la digestión de sustancias insólitas como el toluole o el ácido salicylico.
e. " Virulence plasmids " giran la bacteria en un patógeno.

Plasmids que existe sólo como una copia sola en cada bacteria es, sobre la división de célula, en el peligro de ser perdido en una de la bacteria de segregar. Tal copia sola plasmids tiene los sistemas que intentan activamente distribuir una copia a ambas células de hija.

Algún plasmids incluye un sistema de afición. Ellos producen tanto veneno duradero como su antídoto efímero. La célula que mantiene una copia del plasmid sobrevivirá, mientras la célula sin el plasmid morirá porque esto se queda sin el antídoto dentro de poco.

4. estructura de los plásmidos

Las formas de ADN
Los plásmidos se encuentran principalmente en forma superenrollada en las bacterias. Las formas de ADN pueden visualizarse en el microscopio electrónico como círculos relajados o superenrollados.

Además, pueden identificarse por electroforesis o por centrifugación. En estos casos, la estructura compactada del ADN superenrollado aumenta su migración electroforética y su velocidad de sedimentación, lo cual permite diferenciarlo del ADN circular relajado o del ADN lineal.

Las topoisomerasa I y II
La topoisomerasa II tiene la propiedad de transformar un ADN circular relajado en superenrollado. Este proceso implica pasar de una forma sin almacenamiento de energía a una forma con alto contenido energético, y por lo tanto es necesaria la presencia de adenosinatrifosfato (ATP) como donante energético. Por el contrario, la transformación de ADN superenrollado en relajado con subsecuente liberación de energía es catalizada directamente por la topoisomerasa I sin necesidad de ATP. La ADN girasa es una de las topoisomerasas I.

La ADN girasa
La ADN girasa, como las topoisomerasas, tiene una función muy importante en la modulación del estado topológico del ADN, pues regula su estructura superhelicoidal.

A diferencia de la topoisomerasa 1, la ADN girasa, corta las dos cadenas de la doble hélice del ADN; y actúa en la replicación del ADN. Mientras, la topoisomerasa 1 corta una cadena del ADN para aliviar el superenrrollamiento, y actúa durante la transcripción del ADN.

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almacenamiento, m: storage, warehousing
relajar verbo transitivo: to relax
electroforesis: separación de partículas en suspensión con la ayuda de un campo eléctrico.
centrifugación: separación de partículas en suspensión con la ayuda de un campo gravitacional.

5. transformación

Transformar una bacteria ó una levadura, consiste en introducirle en ella una molécula de ADN extranjero (Avery, McLeod y McCarthy, 1944).
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Basemol/base_molecular_de_la_herencia.htm

Para las células eucariotas (salvo las levaduras), no se dice transformar pero transfectar (transformar una célula eucariota quiere decir hacerla eterna o hacerla cancerosa).

Existen varios métodos para introducir un plásmido en una célula (transformar una bacteria). Cada uno es en sí una receta y cada uno tiene una propia.

Transformación con CaCl2 + choque térmico:
Consiste en añadir plásmidos a las bacterias tratadas con CaCl2 y de someterlas a un breve choque térmico (42°C). La utilización de otras sales que CaCl2 y la adición de iones metálicos aumenta la eficiencia de la transformación.

Para plásmidos de 3 kb, una transformación eficáz produce alrededor de 10+8 colonias/mg de ADN plasmídico superenrollado.

Electroporación:
Es un procedimiento que consiste en someter las bacterias suspendidas en agua a una diferencia de potencial elevado para perforar temporalmente la pared celular.

Otros métodos de transformación:
Utilizan por ejemplo liposomas (son más costosos).

La eficiencia de la transformación es inversamente proporcional a la talla del plásmido. Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores de selección proporcionados por plásmidos.
Los marcadores de selección más utilizados son los gens de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Como regla, las bacterias transformadas se cultivan siempre en presencia del antibiótico para evitar que la bacteria pierda el plásmido que se le ha introducido.

6. Los marcadores de selección

Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores de selección proporcionados por plásmidos.
Los marcadores de selección más utilizados son los gens de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina.

Como regla, las bacterias transformadas se cultivan en presencia del antibiótico para evitar que la bacteria pierda el plásmido que se le ha introducido.

7. el replicón y el orígen de replicación

El elemento genético que controla el número de copias del plásmido se encuentra en una región del ADN plasmídico que incluye el orígen de replicación. El orígen de replicación y los elementos de control asociados definen la unidad genética llamada « replicón ».

8. Clonación

vector de clonaje:
El principio de la clonación en biologia molecular consiste en insertar un segmento de ADN extranjero en una molécula pequeña capáz de replicarse automática. A ése tipo de molécula de ADN se lo denomina vector de clonaje.

plásmidos recombinados:
Los plásmidos son excelentes vectore de clonaje. Puede ser "cortado" con una ó dos enzimas de restricción ó puede incorporársele un fragmento de ADN que ha sido previamente cortado usando mas mismas enzimas de restricción. Los plásmidos así modificados se los denomina plásmidos recombinados. En éste estado, se los introduce entonces en una bacteria donde serán replicados.

Clonado en bacterias es (en biologia molecular)
insertar un segmento de ADN extrangeros en un vector,
transformar las bacterias con este vector y seleccionar las bacterias transformadas.

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Clonación: Quiere decir multiplicación
ori: orígen de replicación.
f1 ori: orígen de replicación del fago f1. Servía antaño para la secuenciación

1. El inserto de un segmento de ADN extranjero en un plásmido:

2. transformación de bacterias por el plásmido.

pGEM®-13Zf(+) Vector sequence reference points.

Sitio de initiación la transcripción por la RNA polimerasa T7
Sitio de initiación la transcripción por la RNA polimerasaSP6
Promotor de la RNA polimerasa T7 (nt 3163­3)
Promotor de la RNA polimerasa SP6 (nt 49-68)
sitio de clonaje (nt 11­43)
codon inicial operon lacZ (nt 90)
secuencia 3000­3160 de lac Z (nt 76­323)
operator 1de lac (nt 10­126)
beta-lactamase coding region (nt 1247­2107)
fago f1 región (nt 2544­2999)

Las ARN polimerasas T7 y SP6.
Las ARN polimerasas T7 y SP6 son ADN dependiente ARN polimerasas. Son muy específicos de sus promotores. Estas dos enzimas permiten la síntesis de sondas ARN para cada cadena del insert. Si ciertos nucleótidos son marcados, las sondas son también marcadas.

Los sitios de clonaje (polylinker):
Los sitios de restricción (Not Im Sfi I y Hind III) han sido obtenidas sin cambiar el número de los nts. Simplemente se cambian el uno o el otro de ellos.

3. selección de bacterias transformadas.

9. cualidades de los plásmidos como vector de clonaje

La mayoría de los plásmidos en uso contienen un replicón derivado del plásmido pMB1, inicialmente aislado de una muestra clínica. En condiciones normales de cultivo, se encuentra un mínimo de 15 a 20 copias de plásmido que contienen el replicón en cada célula bacteriana.

Los plásmidos deben contener marcadores genéticos particulares, como gens de resistencia a antibióticos ó el gen que codifica la ß-galactosidasa.
Los plásmidos deben contener también uno ó más sitios de restricción únicos en una región que no sea esencial para la replicación del plásmido.
Los plásmidos deben tener también sitios de restricción únicos en los gens codantes de marcadores selectivos. Esos marcadores son inactivados cuando en ellos se inserta un fragmento de ADN extranjero.

B. Algunas técnicas de clonaje

 

1. inserción en un gen de resistencia

Se puede clonar un fragmento de ADN en un gen de resistencia a un antibiótico, con la condición de que el plásmido porte al menos 2 gens de resistencia (como pBR 322).

En el ejemplo siguiente, el ADN plasmídico se corta con la enzima Bam HI donde la secuencia de reconocimiento se localiza en el gen de resistencia a la tetraciclina (tetr). El vector digerido por Bam HI se une al fragmento de ADN "b" cuyas extremidades han sido genradas también por la enzima BamHI.

La ligación se realiza por la ligasa de ADN T4 y ATP. El riesgo de que un vector vacío se forme es bién elevado. El producto de la ligado es transformado por la E. coli. Las bacterias son sembradas en medio que contiene la ampicilina. Entre las colonias que sobreviven a la ampicilina, se encuentran plásmidos recombinados y también vectores vacíos que son recirculados sin inserto.

Para diferenciar los 2 tipos de transformados, se replican los cultivos y se siembran en medios que contienen antibióticos, ya sea ampicilina ó tetraciclina.
Las bacterias que no crecen en presencia de tetraciclina pero que crecen en presencia de ampicilina son las que contienen un plásmido recombinado. Este método sinembargo es poco utilizado.

pBR322 es un plásmido comercial de este tipo. El sitio Bam HI y su posición han sido escrita en rojo. Este plásmido es un vector de 4361 bp. Ahora, es poco utilizado, pero, a menudo, se citan en muchos artículos.

2. inserción en LacZ

Los plásmidos de tipo pUC contienen un segmento derivado del operón lactosa de E. coli. Ese segmento codifica el represor, el promotor, el operador y los primeros 146 aminoácidos del gen lacZ (el péptido alfa, un partes de la ß-galactosidasa).

Polilinker:
Se ha insertado, entre los codones 5 y 6 de la secuencia lacZa, un polilinker (región con sitios de clonaje múltiples), básicamente una secuencia corta de ADN que contiene entre 8 a 16 sitios de cortes únicos, por enzimas de restricción. El polilinker no modifica las ventanas de lectura, sinó que proporciona un lugar para la introducción de un número pequeño de aminoácidos en la parte amino-terminal del péptido alfa sin cambiar sus propiedades.

Complementación alfa:
Se muta E. coli para que expriman la ß-galactosidasa sin el peptide alfa. La enzima es entonces inactiva: las dos partes de la ß-galactosidasa son necesarias para formar una enzima activa. Estas bacterias no hidrolisan ni la galactosa, ni el compuesto sintético X-gal.

Cuando se transforma con un vector pUC estas bacterias, este vector les aporta el péptido alfa, que les hace falta, provocando lo que se llama la "complementación alfa".

Las bacterias transformadas por este vector son fácilmente reconocidas puesto que ellas forman colonias azules en presencia de un substrato incoloro X-gal (5-bromo-4 -chloro-3- indolyl-b-D- galactosida). Cuando X-gal es hidrolisado por la ß-galactosidasa produce una substancia azul insoluble en presencia de IPTG (el inductor de la expresión de la ß-galactosidasa ).

Si se inserta un fragmento de ADN extranjero en el polilinker, se destruyen casi todas las entradas de lectura y se para la complementación alfa. Las bacterias con plásmido recombinante forman colonias blancas, puesto que la ß-galactosidasa es inactiva. Este método de coloración permite de identificar de manera simple las bacterias con plásmidos recombinantes.

3. clonaje direccional

La mayoría de plásmidos utilizados actualmente (como el véctor pGEM del ejemplo precedente) contienen polilinkers con varios sitios de restricción únicos que permiten varios usos experimentales. Permite así también de encontrar sitios de restricción compatibles con las extremidades del fragmento a clonar.
Por ejemplo, el véctor pUC19 puede ser digerido por BamHI y HindIII y, luego de la digestión, el gran fragmento del vector puede ser separado del pequeño fragmento correspondiente a partir de un polinker, por electroforésis en gel de agarosa.
El vector puede unirse por ligado a un fragmento de ADN que tiene extremidades compatibles con aquellas genradas por BamHI y HindIII.
Las moléculas de ADN circular obtenidas sont transformadas en la E. coli. Las bacterias transformadas son identificadas por su capacidad de resistencia a la ampicilina. En tanto que no halla complementaridad entre las extremidades adhesivas BamHI y HindIII del vector, la circularización de aquel no es posible.

A pesar de que el vector será transformado con poca eficiencia, la mayoría de las bacterias resistentes a la ampicilina contendran el plásmido recombinado.

4. defosforilación

La T4 DNA ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre los nucleótidos adyacentes solamente si uno de los nucleótidos contiene un grupo 5'-fosfato y el otro un 3'-OH. Los 5'-fosfatos de las 2 extremidades de una hebra linear de ADN en presencia de una fosfatasa intestinal de ternero (CIP) ó alcalina de camarones (SAP) : no permite más la recircularización del vector. Si se une un fragmento de ADN con las extremidades 5'-fosfato al vector desfosforilado, se obtiene entonces una molécula de ADN circular con 2 cortes. Esos cortes son reparados cuADNo el plásmido recombinado se introduce en la bacteria. Como el ADN plasmídico circular es más eficientemente transformado que el ADN linear, la mayoría de transformantes contendrán el plásmido recombinado.
Debido a la facilidad de uso, los plásmidos son los vectores más empleados en ingenría genética. Son los vectores más eficientes de todos si el tamaño del ADN a clonar es inferior a 10 kb. Para fragmentos con tamaño superior a 10 Kb, la eficiencia de transformación se hace demasiado débil.

Si a pesar de todo se decide clonar en un plásmido un fragmento de más de 10 Kb de talla, hará falta tomar precauciones para limitar la recircularisación del vector.

C. El opéron lactosa

1. la ß-galactosidasa:

La E. coli no utiliza la lactosa como tal, sino cuando ésta es hidrolizada en glucosa y galactosa. La ß-galactosidasa hidrolisa la lactosa a partir de un substrato sintético denominado X-gal. Si la galactosa no está presente en el medio de cultivo, la E. coli exprime solamente muy poco de ß-galactosidasa. En cambio, en presencia de lactosa, exprime la ß-galactosidasa abundantemente. Es por ésto que se dice que puede regular la expresión de la ß-galactosidasa. Cuando la ß-galactosidasa entra en contacto con el producto X-gal, ella lo convierte en un producto coloreado de azúl. La ß-galactosidasa es codificado por el géne LacZ.

2. el péptido LacZ alfa:

El péptido LacZ-alfa es la parte de la ß-galactosidasa que no tiene actividad por sí misma, pero que es necesaria para la acción de la enzima. Existen cultivos comerciales de E. coli a los cuales se les ha eliminado el gen del péptido alfa. Cuando los plásmidos contenientes éste gen son introducidos en ésas bacterias, le donan el LacZ alfa que les faltaba.

3. los inductores: lactosa y IPTG:

La lactosa cuando presente induce la expresión de ß-gal. Existen también otros compuestos así capáces de provovar la misma respuesta inductríz. En el laboratorio, uno de los más utilizados es el isopropil- ß -D-tiogalactósido (IPTG). El IPTG no es metabolizado.

4. el operador

El estudio de E. coli mutantes, incapáces de modular la producción de la ß-galactosidasa conducieron a Monod y Jacob a postular la existencia de un sitio de ADN cercano al gen codificador de la ß-galactosidasa sobre el cual se fijaría un represor. Es así, que el adjetivo operador fué donado.

5. El represor-lac puede fijarse en el operador

El ajuste espacial producido por la fijación del represor-lac en el operador no permite que la ARN polimerasa se una al ADN y de comenzar la transcripción del gen que codifica la ß-galactosidasa. El represor­lac es una proteína constitutiva codificada por el gen "i".

 

 

6. la lactosa impide al represor de reaccionar

La lactosa se une al represor y le impide de liarse al operador. En presencia de lactosa el represor es inactivado y el ARNm lac es transcripto. Si la lactosa es eliminada del medio, el represor recupera su capacidad de fijarse al operador y de impedir la transcripción del gen.

7. los otros gens del opéron lactosa:

los otros gens del opéron lactosa:
El gen de E. coli que codifica la ß-galactosidasa (Z) se encuentra adyacente a 2 otros gens implicados también en el metabolismo de la lactosa
la lactosa permeasa: el gen lacY codifica la lactosa permeasa que facilita la entrada de lactosa en la célula.
la thiogalactosida transacetilasa:
El gen lacA, codifica la thiogalactosida transacetilasa, una enzima probablemente implicada en la eliminación de compuestos similares a la lactosa, pero que la ß-galactosidasa no puede separar en metabolitos nutritivos.