plan:

1. las moléculas à secuencar
2. los vectores de secuencaje y los cebadores (primers)
3. la ADN pol
4. La mezcla de dNTPs y ddNTPs.
5. el estiramiento a ± 70°C en un termociclador mediante la ADN pol y los nucleótidos
6. la electroforésis denaturante en el secuenciador
7. los "secuenciadores" en el comercio.


Para secuenciar, se necesita primero la molécula de DNA a secuenciar, un vector de secuencaje, cebadores, una ADN pol, dNTPs, ddNTPs fluorescentes y un secuenciador automático.

1. La molecula a secuenciar

 

Una molécula desconocida.
Fueron 2 grandes grupos de investigadores los que secuencaron el genoma humano
El primer grupo, denominado "Poyecto Genoma Humano", dividió el genoma en muy grandes fragmentos. Aislaron fragmentos de ± 200 000 bp y los insertaron en cromosomas artificiales de bacterias, llamados BACs. Los BACs fueron clonados y compartidos con los diferentes centros universitarios que participaron en el proyecto. Los insertos de BACs fueron enseguida fragmentados en secuencias de alrededor de ± 4 000 bps destinados a ser secuenciados automáticamente. El otro grupo, llamado "Celera Genomics" reportó de haber cortado todos los genomas en secuencias ± 4 000 bp antes de secuenciarlas, dejando que sean las computadoras quienes ordenan el orden de las secuencias contiguas, denominadas contigs.

Se denomina "shotgun" los métodos utilizados para fragmentar las moléculas de ADN. Los shotgun utilizan ultrasondas.

Los secuenciadores automáticos pueden dificílmente secuenciar más de 400 nucleótidos con los mismos cebadores. Es por ésto que fue decidido de sólo secuenciar los primeros 400 y los últimos 400 nucleótidos de cada fragmento. Para mejorar ésta limitación, simplemente se aumentó la cantidad de segmentos secuenciados, con la esperanza de cubrir así todo el genoma, como lo muestra la figura siguiente.
La siguiente figura no muestra los vectores en los cuales las secuencias desconocidas fueron insertadas, sinó las secuencias que se aparejaron con los cebadores que se utilizaron para genrar todos los fragmentos.

En clínica, se conoce la secuencia amplificada. Se poseen los cebadors específicos. El secuencaje sirve únicamente a detectar una ú otra mutación específica.

Cuestiones para el examen

1. ¿ Qué es un ddNTP?
2. Describa un secuenciador automático.
3. ¿ Qué es un BAC?
4. ¿ Qué es un bacteriófago?
5. ¿ Que significa shotgun en Biologia Molecular?
6. ¿ En cuál vector introducimos el fragmento a secuenciar?
7. ¿ Cuál es la longitud del fragmento que un secuenciador automático puede secuenciar?

2. el vector de secuencaje y los cebadores:

el vector de secuencaje:
Como lo mencionamos, se debe insertar un fragmento desconocido en un vector conocido que tenga una zona de anclaje para los cebadores que se utilizan.

Colocamos el fragmento a secuenciar en un vector utilizando por ejemplo la topoisomerasa. Cuando no hay A, aumenta A con la ayuda del polinucleotide kinase.

el cebador:
El primero en la parte de arriba (cebador sens, cebador direccional), el cual permite de secuenciar los 400 nt de una de las hebras y el cebador de la otra hebra, abajo (cebador anti) que permite de secuenciar los 400 nt complementarios. El secuencaje consiste en leer el alineamiento de la extremidad 3' de un cebador:

3. ADN pol por largos nucleótidos:

La Taq polymerasa FS (por ejemplo), es una variante de la lADN polimerasa de la bacteria thermófila Thermus aquaticus, especialmente estudiada para mostrar ése tipo de secuencaje. Tiene un sitio catalítico que a sido modificado de manera que la enzima acepte moléculas más grADNes que la enzima salvaje. En efecto, su sitio catalítico modificado le permite la incorporación de ddNTPs fluorescentes con un mejor rendimiento que las polimerasas tradicionales. Los ddNTPs fluorescentes son en efecto, enormes moléculas!

4. Una mezcla de dNTPs y de ddNTPs
fluorescentes

ddNTPs
La figura siguiente muestra a un ddNTP. Se puede ver que parte de un dNTP donde la desoxiribosa no tiene OH en 3'. Los ADN pols no diferencian entre dNTPs y ddNTPs. Sin embargo, cada vez que ellas ajustan un ddNTP, la cadena se termina, y no hay más manera de ajustar otro nucleótido. Puesto que los ddNTPs terminan las cadenas, se les denomina terminadores.
El reporte ddNTPs/dNTP ha sido calculado de manera que la ADN pol pueda terminar ciertas cadenas y continuar otras. El objetivo es el de obtener todas las cadenas posibles con el número de nucleótidos presentes en la secuencia.

los BigDye Terminators:
Applied Biosystems (AP) ha desarrollado terminadores de alargamiento de gran sensitividad: los BigDye Terminators. Los ddNTPs de AP, como aquellos de otros, han sido marcados con 4 fluorocromos diferentes. Su estructura contiene un donor fluorescente, como el 6-carboxyfluorescein enlacado a un aceptor, una diclorohodamina específica de cada base. La excitación se realiza usADNo 2 longitudes de onda diferentes (488 y 514 nm) con un láser de argón. La emisión se mide a 4 longitudes de onda correspondiente a 4 fluorocromos. Cada base dona una señal específica que permite de identificarla cuADNo pasa enfrente de un fotómero situado a la salida del capilar.

El análisis de las señales recibidas se realiza con la ayuda de computadoras, permitiendo de reconstituír así, la secuencia con una gran precisión.
Así se comprende porqué esos terminadores son voluminosos y porqué se utiliza una ADN pol modificada.

5. El estiramiento a ± 70°C en un termociclador

El tubo que contiene el cebador, el molde ó secuencia diana, y la l'ADN pol se meten en un termociclador calibrado a óptima temperatura para la actividad polimerásica. La mezcla se la deja el tiempo suficiente para que el alargamiento de los cebadores a un poco más de 400 nt se produzca.

El estiramiento se realiza así: la polimerasa alarga el extremo 3' del cebador, utilizADNo el molde como modelo. Ella añade el primer nucleótido (ver figura abajo), sea un dTTP ó un ddTTP. Si ella añade un ddTTP, la cadena no puede estirarse más y se colorea en rojo (como en la figura). De otra manera, ella añade un dTTP (en negro). El dTTP permite que la polimerasa continue y añada otro nucleótido que puede ser un dTTP ó un ddTTP. Según la elección, la cadena continua y se alarga, ó se termina.

Entre 200 a 500 ng de ADN plasmídico ó fágicos se necesitan para realizar una electroforésis de secuencaje, osea de 30 a 90 ng de un producto PCR. La diferencia es debida al fago ó al plásmido. Ese ADN debe ser purificado, precipitado con alcohol a 66% y acetato de sodio. También debe haber sido disuelto en una solución denaturante (formamida).

La suspensión se la transfiere en un tubo de secuencaje donde primero se la desnatura a 95°C y luego se lo enfria rápidamente en hielo. Los tubos se los mantiene a 4 °C mientras se espera que sean inyectados en los capilares del secuenciador.

6. la electroforésis denaturante:`

Los productos obtenidos se los somete a una electroforésis capilar en el "secuenciador ".
El principio de la máquina es simple y se resume en la gráfica siguiente: El capilar contiene una resina comercial, cuya composición es secreta. Una extremidad del capilar es insertada en el tubo de la muestra, que a su vez contiene un electrodo (-). Una fuerte diferencia de potencial se crea y permite de "aspirar " rápidamente una alícuota en el capilar. La extremidad del capilar es enseguida transferida en la cubeta que contiene el tampón de electroforésis., que a su vez contiene electrodos (-). La otra extremidad del capilar se deposita desde el comienzo dentro de otra cubeta que contiene tampón y el electrodo (+).

A lo largo del capilar se encuentra una ventanita de cuarzo. Al frente de la misma el emitor laser y detrás el detector. Su función: detectar el paso de las bADNas fluorescentes y de comunicar eso a la computadora.
Todas éstas manipulaciones son realizadas automáticamente, aún el llenado de los capilares y pasado por la resina.

El investigador simplemente introduce la muestra preparada y leé los resultados en la pantalla. Ocasionalmente debe responder a la computadora cuADNo ésta demADNa de renovar los tampones, la resina ó ayuda cuADNo los resultados don difíciles de interpretar.

Los resultados se afichan en el monitor como en la figura, y los picos corresponden a la fluorescencia inducida por los láser y detectadas con el detector. Los colores de los picos no corresponden a aquellos de la exposición

7. Los secuenciadores en el comercio


Este secuenciador se compone de:
a. De un suporte para las muestras (la foto muestra el sistema Beckman-Coulter).

b. De 4, 8, 16 ó 96 capilares (dependiendo de los fabricantes). Es en los capilares que la electroforésis se realiza. Cada capilar poseé una ventana de cuarzo que permite la lectura de la señal fluorescente.

c. Un láser y una célula de detección.