biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
El hacer callar del ARN
Jean-Pierre HERVEG* y Maritza BARCIA-MACAY**
*Université de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.

Cochabamba, Bolivia, abril 2006

los miARN
plan
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Introduction:


El hacer callar del ARN (RNA silencing) es un sistema de vigilancia que ocurre en los organismos eucaryoticos incluyendo hongos, animales y plantas. Se llama "represión" en los hongos, RNAi (el "i" significa interferencia) en los animales y PTGS (post-transcriptional gene silencing) en las plantas.


ARNi:

La interferencia de ARN (ARNi) es un mecanismo de hacer callar que inhibe "in fine" la producción de una proteína determinada. La ARNi participa a la protección de la célula contra el ARN de virus y transposons, a la regulación de la identidad de las células durante el desarrollo y al control de la estructura de la chromatin. A menudo, RNAi actúa en el nivel de la post-transcripción para hacer callar la expressión de unos mARNs (producción de las proteínas). Sin embargo, en varios casos esto actúa en el nivel de la chromatin y del ADN. Por ejemplo, RNAi media (1) la metilación de ADN e (2) la metilación del histone H3-K9 en plantas, (3) la eliminación de ADN en Tetrahymena, y (4) la formación de la heterochromatina en regiones de ADN centromeric en el ser humano, la drosofila, y Schizosaccharomyces pombe. En ciertos organismos, la inhibición es transmitida por células a células y es hereditaria.

el nuclear RNAi:

La inhibición producida por el RNAi tiene principalmente lugar después de la transcripción. Sin embargo la causa del fenómeno puede ser localizada en el núcleo mismo. En más RNAi Puede tener un papel en la formación de la heterocromatina y ser implicado en la inhibición de la transcripción misma. Estos fenómenos que se pasan en el núcleo son llamados "el nuclear RNAi"

siARNes:
El hacer callar por el sendero de RNAi es iniciado por el ARN doble cadenas (dsRNA). Este dsARN proviene de virus, de transpongamos o ha sido introducido en célula por el experimentador. Este dsARN Está procesado en el citoplasmq por la ribonucleasa Dicer en pequeños ARNes (± 23 nucleótido) , pequeños ARNes llamados siRNAes. Cuando actúa al nivel post-transcriptionel, el siARN se pone en contacto con el complejo RISC y el ameno RISC (RNA-induced silencing complex ) hacia el región de ARN al cual es complementario. Las proteínas


Argonautes de RISC inactivan entonces el ARN en cuestión. La inhibición específica de los genes producida por el dsRNA es un mecanismo regulador en casi todas las células eukaryotas. dsRNAs puede provenir de varias fuentes. Ellos pueden surgir durante (1) la infección viral y la réplicación (2) después de la transposición de elementos genéticos móviles(3) después de la transcripción de pseudogenes, (4) de endógenos repetidores génicos.

miARN:
miRNA son producidos por las acciones sucesivas de dos RNASE III ribonucleases. Después de su transcripción por la polimerasis de ARN II, miRNA primario (pri-miRNA) es hendido en el núcleo por Drosha, probablemente como un complejo heterodimeric con la proteína Pasha, que forma el complejo de microprocesador caprichosamente llamado. Drosha la hendidura genera el pre-miRNA, que ata Exportin 5 y es exportado al citoplasma. En el citoplasma, el Jugador, como se piensa, ata la base del tallo de pre-miRNA definido en el núcleo por Drosha. La hendidura de jugador libera una comprensión duplex el miRNA y los hilos de miR del pre-miRNA. El miRNA entonces debe ser desenrollado y con criterio selectivo incorporado en RISC por la maquinaria de asamblea miRNA-específica RISC.

referencias:
Two RNAi Complexes, RITS and RDRC, Physically Interact and Localize to Noncoding Centromeric RNAs
Mohammad R. Motamedi, André Verdel, Serafin U. Colmenares, Scott A. Gerber, Steven P. Gygi, and Danesh Moazed
Cell, Vol 119, 789-802, 17 December 2004

Human Argonaute2 Mediates RNA Cleavage Targeted by miRNAs and siRNAs
Gunter Meister, Markus Landthaler, Agnieszka Patkaniowska, Yair Dorsett, Grace Teng, and Thomas Tuschl
Molecular Cell, Vol 15, 185-197, 23 July 2004

Minireview
The Role of the RNAi Machinery in Heterochromatin Formation
Michael Wassenegger
Cell, Vol 122, 13-16, 15 July 2005

los miARN
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El nuclear RNAi:


el complejo RITS:
La formación del nuclear RNAi es bien descrita en una levadura, S. pombe. La primera etapa es la síntesis de dsARN. Este dsARN luego es cortado en fragmentos de 22-23 nt por la nucleasa Dicer. Estos fragmentos son siRNA. Estos fragmentos luego son incorporados en el complejo RITS (RNA-induced initiator of transcriptional gene silencing). Esta incorporación se hace con la ayuda de la proteína
AGO1. El fragmento guía entonces el complejo RITS hacia el genoma. No sabemos si el complejo directamente se aparea al genoma o en los trancripts en formación. El complejo atrae las enzimas que van a modificar la cromatina. Entre éstas, hay la metiltransferasa Clr4 que colocará un metilo sobre el lisina 9 del histona 3 (H3K9). Este metilación estabiliza la fijación del complejo RITS sobre la cromatina.

RITS se fija sobre el ADN:
Esta interacción con la H3K9 metitransferasa da a pensar que RITS se fija sobre el ADN y no sobre ARN naciente, Excepto si ARN naciente también es fijado, sobre el cromatina. El complejo RITS reactúa entonces con el complejo RDRC (RNA-directed RNA polymerase complex) requerida para formar el dsARN secundario.




RITS se fija sobre el ADN:
Esta interacción con la H3K9 metitransferasa da a pensar que RITS se fija sobre el ADN y no sobre ARN naciente, Excepto si ARN naciente también es fijado, sobre el cromatina. El complejo RITS reactúa entonces con el complejo RDRC (RNA-directed RNA polymerase complex) requerida para formar el dsARN secundario.

RDRC produce constantemente dsRNA:
En casa de S. pombe, el complejo RDRC contiene una ARN polimerasa (RdRP), una helicase (Hrr) y una proteína útil para la poliadenlación del ARN. No sabemos para el que sirve esta poliadenlación. Sabemos solamente que RdRP es nécéssaire para la producción de siRNA y por a formación de la heterocromatina. Una vez el RITS fijado sobre el cromatina, RDRC produce constantemente dsRNA a partir de los trancripts en formación.

Las hipótesis actuales que conciernen el modo precisa de esta inhibición son presentados en un artículo reciente:
Minireview
The Role of the RNAi Machinery in Heterochromatin Formation
Michael Wassenegger

Cell, Vol 122, 13-16, 15 July 2005


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En las plantas:

Una característica del proceso de silencing es su acción al nivel local, la célula vegetal y al nivel general, toda la planta.

Hacer callar autónomo de célula.
La activación de hacer callar de ARN en una célula de planta conduce al tratamiento de dsRNAs a siRNAs y a la degradación de ARNes cognados (mencionó el hacer callar autónomo de célula)

Hacer callar sistémico.
Esto causa la generación de una señal móvil, que se extiende en la planta y causa la degradación de ARN específica de secuencia células distantes (el hacer callar sistémico)

La proteína p19 de CymRSV:
El virus Cymbidium ringspot (CymRSV) contiene un sentido positivo ssRNA genoma con cinco marcos de lectura abiertos (Open reading frames, ORFs). La proteína p19 codificando por el ORF5 es un supresor del hace callar.

CymRSV infecta Nicotiana benthamiana y mata el huésped dentro de 2 semanas: Sin embargo, la infección con un mutante, en el cual p19 era inactivated (Cym19stop), causa un fenotipo parecido a una recuperación mostrando a síntomas suaves.

P19 inhibe el hacer callar de ARN en planta por secuestrando siRNAs. En plantas infectadas con CymRSV, siRNAs está presente en complejos con p19 (p19-siRNA), mientras en plantas infectadas por el mutante p19 defectuoso (Cym19stop) siRNAs fueron encontrados en formas libres.
P19 suprime el hacer callar de ARN en la Drosófila por la prevención de la formación de un complejo RISC activo.

Gene & Development 19:517-529, 2005
Post-transcriptional Control
REVIEW: Perspective: machines for RNAi
by Yukihide Tomari and Phillip D. Zamore

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En la drosofila:


la carga de RISC

El paso central de asamblea de RISC es la carga de uno de los dos hilos de siRNA en RISC. La asamblea de RISC sólo ha sido estudiado en vitro para la Drosófila, entonces aún no sabemos si los datos puede ser generalizado a otros organismos.

Dicer: Dcr-1 y Dcr-2
En la drosofila, siRNA y miRNA son producidos por enzimas distintas Dcr-1 y Dcr-2 (Dcr significa Dicer). Drosofila Dcr-1 produce miRNAs, mientras que Dcr-2 hace siRNAs. Dcr-2 también actúa para cargar uno de los dos cadenas de siRNA en RISC. El Dicer Humano también puede funcionar en la carga siRNA en RISC: porque siRNA saca el hacer callar en células humanas que carecen Dicer. Al contrario siRNAs funciona para reducir la expresión génica en ES células faltan Dicer

la carga de RISC in human
Perhaps Dicer is only required in human cells to load Ago2-containing RISC complexes, much as Dcr-2 is required only to load Ago2 in Drosophila.


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En los Entamoeba histolytica:

El hacer callar de genes ocurrió en dos niveles: transcriptional (TGS) y posttranscriptional (PTGS).

En transgenic plantsTGS ha mostrado para ocurrir después de la inserción de múltiples repeticiones homólogas de una región del promotor del transgene. Esto puede causar una supresión heredada del gene que es en el control de este promotor. TGS en plantas tiene correlación a menudo con la condensación de la metilación de ADN y chromatin.

Al contrario PTGS en plantas (así como reprimiendo en Neurospora) ha mostrado para requerir sólo la inserción transgene de secuencias homólogas transcritas. Una característica con frecuencia encontrada y notable de PTGS es la presencia de moléculas de ARN cortas, no productivas. Nuestros resultados presentes sugieren que el hacer callar del gene Ehap-a en Entamoeba pertenezca al TGS.

El hacer callar de la transcripción del gen que codifica para amoebapora ( AP-A) es observado cuando trophozoitos de Entamoeba histolytica son transfectados con un híbrido plásmido construcción que contiene el gene AP-A al lado del corriente segmentos upstream and downstream del gen Ehap-a (Eh means E. histolytica) .

Transfectadas células eran totalmente desprovisto de transcripción ap-a y la proteína AP-A. Un efecto de hacer callar idéntico es observado sobre transfection con un plasmid que contiene sólo los 5' upstream región de ap-a. El retiro del medio del antibiótico seleccionando permitió el aislamiento clones sin plásmido, que conservaron en su progenie el fenotipo hecho callar.

Células de E. histolytica son capaz de sobreexpresar ap-a cuando transfected con un plasmid que contiene el gene de ap-a al lado de las 5 ' y 3 ' regiones del gene EhRP-L21. Este plasmid, sin embargo, no podía expresar ap-a en el retransfected, clonados trophozoitos clonados que carece AP-A.

Esto es el primer informe de hacer callar de gene en E. histolytica: El mecanismo aparece pertenecer al hacer callar de gene transcriptional y no al hacer callar post-transcriptional génico. Esta conclusión está basada en los resultados siguientes: (i) hacer callar fue alcanzado por transfection de homólogos del 5' flanking secuencias (470 bp del gene Ehap-a), (ii) la iniciación de transcripción de Ehap-a fue encontrada para ser bloqueado, y (iii) fragmentos de ARN cortos dobles-varados del ap-a secuencias que cifran y no cifran no fueron descubiertas. Trophozoitos careciendo AP-A son no patógeno y perjudicado en su capacidad bacteriolytic.

Eukaryotic Cell, April 2003, p. 295-305, Vol. 2, No. 2
1535-9778/03/$08.00+0
Copyright © 2003, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Transcriptional Silencing of an Amoebapore Gene in Entamoeba histolytica: Molecular Analysis and Effect on Pathogenicity
Rivka Bracha, Yael Nuchamowitz, and David Mirelman*

Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science, Rehovot 76100, Israel

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En los Trypanosoma brucei:

La interferencia de ARN (RNAi) es un mecanismo que hace callar un gen. Este mecanismo es provocado por el ARN doble- cadena (dsRNA). RNAi es operacional en un número grande de organismos eukaryotic, incluyendo el protisto Trypanosoma brucei. En años recientes, la participación de RNAi ha sido descubierto en una variedad de fenómenos que efectúan el hacer callar de gene en el nivel de ADN o el ARN. Estos incluyen la degradación mRNA, la represión de translación o transcriptional, la metilación de las histonas y del ADN, y la eliminación programada de ADN.

Estos fenómenos que hacen callar gene podrían aparecer bastante diferentes, ellos hasta ahora comparten dos características:

(1) ellos comparten la presencia de pequeños ARNes ~20-26-nucleotide-long, mencionó pequeños entrometidos ARNes (siRNAs) o microRNAs. Ellos son producido como consecuencia del hendimiento del dsRNA por un endonuclease llamado Dicer.

(2) ellos comparten la incorporación de estos pequeños ARNes en un multimeric ribonucleoprotein el complejo, conocido como RISC (RNA-induced silencing complex) conteniendo al menos un miembro de la familia de proteína Argonaute (AGO).
La familia de proteínas Argonaute primero fue definida en Arabidopsis thaliana por vía de una pantalla genética. Posteriormente, Argonaute fue unida para ARNi por estudios bioquímicos en la Drosófila. En los protistos aparece haber un o dos genes de esta familia, mientras que en organismos multicelulares esta familia génica se ha ampliado para incluir hasta 24 miembros de familia como en el caso de Caenorhabditis elegans. Argonaute proteínas son caracterizados por dos dominios: un dominio PAZ de ~110 residuos encontrados cerca del medio de la proteína y un C-terminal Piwi dominio.

(1) el dominio PAZ como un módulo capaz de atar ARN, y este dominio podría funcionar como un sitio que ancla para la 3'- proyección de dos nucleótidos de siRNAs.

(2) El dominio Piwi, de 300 aminoácidos, muestra un alto grado de semejanza entre miembros de familia Argonaute y está presente en prokaryotes. Estudios muy recientes estructurales han revelado que Piwi es similar a un dominio de la RNase H, así apoyando un modelo para Argonaute como el nuclease responsable de la hendidura del mRNA.

La medio vidas del ARNm de los eukaryoticas células es determinadas por secuencias en las 3'-UTRs y la degradación generalmente es iniciada por acortando de la cola poli (A).

Function of the Trypanosome Argonaute 1 Protein in RNA Interference Requires the N-terminal RGG Domain and Arginine 735 in the Piwi Domain*{boxs}
Huafang Shi{ddagger}, Elisabetta Ullu{ddagger}§, and Christian Tschudi{ddagger}¶||
From the Departments of {ddagger}Internal Medicine, §Cell Biology, and ¶Epidemiology and Public Health, Yale University Medical School, New Haven, Connecticut 06536-0812
J. Biol. Chem., Vol. 279, Issue 48, 49889-49893, November 26, 2004
pdf
A role for the exosome in the in vivo degradation of unstable mRNAs
SIMON HAILE1, ANTONIO M. ESTÉVEZ and CHRISTINE CLAYTONZentrum für Molekulare Biologie de Universität Heidelberg (ZMBH), D-69120 Heidelberg, Germany
RNA (2003), 9:1491-1501. Published by Cold Spring Harbor
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El hacer callar del ARN
Jean-Pierre HERVEG* y Maritza BARCIA-MACAY**
*Université de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.

Cochabamba, Bolivia, abril 2006