Preguntas para el exámen

1. Definir pre-miARN, pri-miARN, miARN y RISC ?
2. ¿ Cuál es el papel de Drosha y Dicer ?
3. ¿ Cuál es el papel de exportina-5 en la génesis de los miARNs ?
4. Describa las extremidades de un miARN.
5. Describa el papel de Pasha ó DGCR8.
6. Cuántos dominios RNase III se encuentran en Drosha y Dicer.
7. ¿ Para qué sirve el dominio "PAZ"?
8. ¿Qué sabe sobre Lin-4 y sobre Let-7?

Questions for the examination

1. What are pre-miARN, pri-miARN, miARN and RISC ?
2. What is the role of Drosha and Dicers?
3. What is the role of exportine-5 in the processing of miARNss?
4. Describe the extremities of a miARN.
5. Describe the role of Pasha or DGCR8.
6. How many RNase III domain could be found in Drosha and Dicer.
7. What does the "PAZ" domain do ?
8. What do you know about Lin-4 y and Let-7?

Introducción

Los miARNes (micro ARNes) son codificados por genes específicos los cuales son muy conservados. miRNAs constituyen hasta el 1 % del número total de genes en el genoma animal, incluyendo Caenorhabditis elegans, la Drosófila, el ratón, y los seres humanos. En el ser humano, se conocen más de 200 genes diferentes que codifican miRNAes. miARNes son una clase de ARNes pequeños (22-nt) que disminuyen la traducción del ARNm. En plantas, la mayor parte de genes miRNA atan secuencias perfectamente y conducen a la degradación del mRNA. En la mayor parte de animales, ellos previenen la traducción sin la degradación de los ARNm. El mecanismo por el cual miRNA - regula la traducción de los mRNA permanece desconocido.

El gen que codifica un miRNA está primero transcrito en un pri-miARN por la ARN pol II. El transcrito es primero atado "spliced", porque contiene introns. Una parte del pri-miARN se repliega sobre él misma para formar localmente un *dsARN. La nucleasa Drosha secciona este pri-miARN para hacer un pre-miARN. Este pre-miARN sale del núcleo. En el citoplasma, otra nucleasa, Dicer, corta el pri-miARN liberando un ds-miARN de 17 a 24 nt. Una de las secuencias (**ssARN) es incorporada de manera semejante al complejo ***RISC del siARN.

Introduction

miRNA (micro ARNs) are coded by specific and conserved genes. miRNAs constitute almost 1 % of all the genes in an animal genome, including Caenorhabditis elegans, Drosophilla and the mouse. In human, 200 different gens are known which codes for miRNAs. miRNAs belong to a class of small RNAs (22-nt) that decrease the translation of mRNA. In plants, most miRNAs are perfectly complementary to mRNA and this mRNA is the degraded. For most animals, translation is inhibited without any degradation of the mRNAs. The way in which miRNAs control translation is still unknown.

Este curso es inspirado por los artículos siguientes:

Dispatch: MicroRNA Biogenesis: Drosha Can't Cut It without a Partner, by Yukihide Tomari and Phillip D. Zamore
Current Biology, Vol 15, R61-R64, 26 January 2005

Involvement of MicroRNA in AU-Rich Element-Mediated mRNA Instability, by Qing Jing, Shuang Huang, Sabine Guth, Tyler Zarubin, Andrea Motoyama, Jianming Chen, Franco Di Padova, Sheng-Cai Lin, Hermann Gram, and Jiahuai Han,
Cell, Vol 120, 623-634, 11 March 2005

Review: Transcription and Processing of Human microRNA Precursors, by Bryan R. Cullen
Molecular Cell, Vol 16, 861-865, 22 December 2004

RAS Is Regulated by the let-7 MicroRNA Family
Steven M. Johnson, Helge Grosshans, Jaclyn Shingara, Mike Byrom, Rich Jarvis, Angie Cheng, Emmanuel Labourier, Kristy L. Reinert, David Brown and Frank J. Slack
Cell, Vol 120, 635-647, 11 March 2005
Incorporating structure to predict microRNA targets
Harlan Robins, Ying Li, and Richard W. Padgett
PNAS March 15, 2005, vol. 102, no.11, page 4006­4009

Report: The Human DiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8 and Its D. melanogaster Homolog Are Required for miRNA Biogenesis
Markus Landthaler, Abdullah Yalcin, and Thomas Tuschl.
Current Biology, Vol 14, 2162-2167, 14 December 2004

*dsARN: double strand (doble cadena) ARN
**ssARN: single strand (cadena sola) ARN
***RISC: RNA-induced silencing complex

La producción del miARN

En las células de mamíferos, los miARNes son producidos a partir de moléculas de dsARN endógenas que han sido modificadas sucesivamente por las endoribonucleasas Drosha y Dicer. La secuencia miARN está incorporada a un complejo proteico semejante a RISC.

Drosha
Drosha es una endonucléasa que corta las moléculas de dsARN en el núcleo (ver la figura de derecha). El pre-miARN es transportado al citoplasma por exportina-5.

Dicer
Dicer continúa en el citoplasma las modificaciones que Drosha inició en el núcleo: corta una segunda vez al pre-miARNes. Las secciones producidas por Drosha y Dicer liberan los ds-miARNes (duplex). Los ds-miARNes son fragmentos de dsARN de una veintena de nucléotides (nt). Estos fragmentos tienen a las extremidades 3 ' un saliente de 2 ó 3 nt.

complejo proteico semejante a RISC:
Las secuencias de cada segmento de dsARN de 17-24 nt recortado por Dicer y probablemente siempre asociado con él, son separadas. Un secuencia es incorporada a un complejo de ribonucleoproteína (RNP). Este complejo, contiene proteína de la familia " Argonaute ". Este complejo es semejante al complejo RISC (RNA-induced silencing complex). El complejo RISC de las células de drosofila contiene la proteína argonaute 2 (Ago2).

Pasha / DGCR8
Hay una proteína que se fija sobre Drosha. Se llama Pasha en la drosofila, ó DGCR8 en Caenorhabditis elegans y en los mamíferos. Esta proteína actúa con Drosha para transformar el pri-miRNA en pre-miRNA. Pasha / DGCR8 directamente se pega a la región central y a los dominios *RNASE III de Drosha (RIIIDS). La transformación de pri-miARN pre-miARN necesita la presencia de Drosha, pero también de Pasha / **DGCR8. Drosha sola actúa sin especificidad, es Pasha ó sus equivalente los que le confieren esta especificidad. Dicer puede cortar sólo.

El "micro Processor"
El micro procesador es una vista del espíritu. Es el "lugar", en el núcleo, donde el pri-miRNAs habrían transformado al pre-miRNAs. Contendría una ó varias copias de Drosha y de los equivalentes de Pasha. Contendría posiblemente también otras proteínas.

*RNase III:
Las endonucleasas RNase III cortan el dsARN, utilizando el ion Mg2 + para acelerar la catálisis. La endonucleasa RNase III típicamente contienen el dominio RIIIDs y un dominio que fija el dsARN. Las endonucleasas RNase III son repartidas en tres clases. La clase I se encuentra en las bacterias y en las levaduras. Drosha pertenece a la clase II, contiene dos RIIIDs. Dicer pertenece a la clase III, posee cuatro dominios: dos RIIIDs, un dominio helicasa y un dominio la PAZ (puede atarse a las extremidades ssARN, a extremidad 3' de los dúplex siARN).
**DGCR8 significa DiGeorge syndrome critical region gene 8
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..
ShowSection&rid=gnd.section.150°

Mecanismo de la inhibición:

A. Represión de la traducción:
No conocemos los mecanismos de la inhibición. En animales, los miRNAs controlan la expresión de un gene por su complementariedad a elementos en las regiones 3' introducidas (3'-UTRs) de su mensajero objetivo ARNes (ARNm)
(Cell, Vol 120, 635-647, 11 March 2005)


B. Represión de la transcripción de los genes:
Los procesos ARNi-asociados también han sido asociados con la inhibición de la expresión genética como consecuencia de hacer callar la transcripción genética. Se trataría de una modificación de la cromatina debida a una metilación del ADN.

C. La estabilidad del mARNes
La estabilidad del mARNes es ajustada por una variedad de señales que actúan sobre secuencias específicas dentro del ARNs. Los elementos ricos en AU (AREs, AU-rich elements) son localizados en la región 3 ' no traducida (3'UTR) de mRNAs efímeros como los de los citokinas y protooncogenes. Los AREs son la cosa más visible entre los elementos desestabilizadores identificados hasta ahora. La función de desestabilización de los elementos AREs es reglamentada por factores específicos que se fijan sobre estas secuencias. Varias proteínas que se fijan sobre los AREs han sido identificadas.

miR16 es un miRNA humano que contiene la secuencia UAAAUAUU. miR16 es complementario a la secuencia ARE y necesario a la destrucción del ARE-ARNs. El papel de miR16 en esta destrucción es específico y exige que la proteína tristetraprolin (TTP) sea fijada sobre el ARE.

lin-4 y let-7

Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis
Angie M. Cheng, Mike W. Byrom, Jeffrey Shelton and Lance P. Ford
Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 4 , 1290­1297

miARNes son una clase muy frecuente de ARNes celulares, pero debido a que ellos sólo recientemente han sido identificados, muy pocos miRNAs tienen funciones celularas conocidas.

Lin-4
Corrientemente, miRNA mejor entendido, lin-4, primero fue identificado en el nemátodo Caenorhabditis elegans. La investigación reveló que lin-4 se acumula durante las primeras y segundas etapas larvales y provoca el paso a la tercera etapa larval reprimiendo la traducción de al menos dos genes, lin-14 y lin-28.

La actividad de lin-4 depende de la homología parcial del miRNA a las regiones específicas de las 3' de las regiones introducidas (3'-UTRs), del mARNes de lin-14 y lin-28.

let-7
Un segundo miRNA, let-7 se acumula durante el desarrollo larval de C. elegans: ésto provoca el paso de larvas a células adultas. La disminución de Let-7 regula al menos dos genes objetivos, lin-41 y hbl-1.

En el ser humano, los 3 '-UTRs de los genes RAS contienen múltiples LCSs (LCS significa let-7 complementary sites o complementario a los sitios Let-7), permitiéndole a Let-7 de regular la expresión RAS. Let-7 expresión es inferior en los tumores pulmonares que en el tejido normal pulmonar, mientras que la proteína RAS es considerablemente más expresada en tumores pulmonares, proporcionando tal vez un mecanismo para Let-7 en el cáncer.
(Cell, Vol 120, 635-647, 11 March 2005)

miRNA reportero vectores para analizar la actividad del miRNA

Hay, entre el miARNes que se conoce, secuencias que se fijan sobre secuencias complementarias situadas en la región 3 '-UTR de algunos ARNm.

Se fabrican vectores de expresión para células eucarióticas que contienen el gen del luciferasa. En la región 3'UTR del gen de la luciferasa, se insertan regiones que fijan a tal ó tal miARN.

Se pueden así someter a un test el papel de los ARNes antisentido ó de mudanzas de la región sobre la expresión de la luciferasa y sobre la fijación del miARN.

Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 4 , 1290­1297

siRNA contra la región de lazo de un precursor miRNA puede usar y agotar el microRNA. El agotamiento de miR-125b por este método tiene un efecto profundo sobre la proliferación adulta de células de cáncer diferenciadas y éste defecto de proliferación han sido rescatados por la co-transfeccción de microRNA maduro .

Dos forma de precursores de horquilla predicha para miR-125b es mostrada. rojo: maduro, la secuencia miR-125b. verde: las secuencias objetivo de siRNAs..

Depletion of human microRNA miR-125b reveals that it is critical for the proliferation of differentiated cells but not for the down-regulation of putative targets during differentiation.
Lee YS, Kim HK, Chung S, Kim KS, Dutta A.
J Biol Chem. 2005 Feb 18; [Epub ahead of print]

Utilizar el dibujo de la derecha para explicar el de la parte superior: